论文部分内容阅读
几丁质脱乙酰酶催化水解几丁质的N-乙酰基生成壳聚糖。壳聚糖已经被广泛应用于各个领域，例如，生物医学、食品添加剂、化妆品、药品等领域。用几丁质脱乙酰酶将几丁质转化为壳聚糖与传统的化学法相比，生产过程可控，可以用来生产新型的、性质优良的壳聚糖低聚物和聚合体。 本实验成功从构巢曲霉（Aspergillusnidulans）AF97026中克隆出2条几丁质脱乙酰酶基因的DNA和cDNA序列。an1852的DNA和cDNA序列大小分别为906bp和750bp，编码249个氨基酸，理论分子量为27.5kDa，理论等电点为4.84。an1852包含3个外显子和2个内含子，外显子大小分别为338bp，365bp和47bp，内含子大小分别为86bp和70bp。外显子和内含子的切割点符合GT/AG规则。an9380的DNA和cDNA序列大小分别为843bp和714bp，编码237个氨基酸，理论分子量为26kDa，理论等电点为4.6。an9380包含3个外显子和2个内含子，外显子大小分别为293bp，368bp和53bp，内含子大小分别为71bp和58bp。外显子和内含子的切割点符合GT/AG规则。信号肽预测表明AN1852和AN9380的N端分别存在由28个和18个氨基酸编码的信号肽，说明它们均为胞外酶。进化分析表明，在选定的真菌中，几丁质脱乙酰酶的聚类分析情况与经典分类法相符合。 将2个几丁质脱乙酰酶基因的cDNA片段构建到带有高效启动子的穿梭质粒pYES2上，得到2个CDA基因的表达载体。将以上2个表达载体转入酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）INVSc1细胞中，通过酿酒酵母菌落PCR和双酶切鉴定，证实了转化的成功，得到了带有an1852和an9380片段的酿酒酵母（S.cerevisiae）INVSc1转化子。通过Northern杂交检测目的基因在酵母中的表达情况，结果显示an1852在半乳糖启动子的调控下成功表达。对转化子AN1852进行酶活检测发现，转化子培养至36小时酶活达到高峰，最高酶活为0.0035U/mL，且酶活变化情况与mRNA的表达规律相一致。 鉴于构巢曲霉的几丁质脱乙酰酶具有诸多优良特性，其基因克隆及高效表达的成功，将为今后CDA作用机制的进一步研究及CDA的利用奠定基础。