【摘 要】
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菠萝（Ananas comosus（L.）Merrill）为热带亚热带四大名果之一,种植领域分布广泛,食用、药用及观赏价值较高,传统育种周期长,优质种苗规模化繁育困难,其基因工程育种缺乏高效可靠的离体再生和遗传转化体系。因此,本研究以节间和茎基部为外植体,分别建立了‘巴厘’菠萝直接再生体系和间接再生体系;以茎基部为外植体开展了‘巴厘’菠萝遗传转化体系研究,为菠萝基因工程育种、细胞工程育种、遗传资源
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菠萝（Ananas comosus（L.）Merrill）为热带亚热带四大名果之一,种植领域分布广泛,食用、药用及观赏价值较高,传统育种周期长,优质种苗规模化繁育困难,其基因工程育种缺乏高效可靠的离体再生和遗传转化体系。因此,本研究以节间和茎基部为外植体,分别建立了‘巴厘’菠萝直接再生体系和间接再生体系;以茎基部为外植体开展了‘巴厘’菠萝遗传转化体系研究,为菠萝基因工程育种、细胞工程育种、遗传资源改良提供了一套崭新的技术系统。以节间为外植体,通过直接不定芽诱导途径,建立了‘巴厘’菠萝高效直接再生体系,结果表明:（1）节间直接不定芽诱导的最佳配方为MS+3.0mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA,不定芽诱导率达84.44%,平均芽数42.67个/外植体;（2）直接不定芽伸长的最适培养基配方为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA,在光照条件下培养,伸长率达到92.22%,平均芽苗长度为3.87 cm;以茎基部为外植体,通过间接不定芽诱导途径,建立了‘巴厘’菠萝高效间接再生体系,结果表明:（1）茎基部愈伤组织诱导的最适配方为MS+5.0mg·L-12,4-D+2.5 mg·L-1KT,愈伤组织诱导率为93.33%;（2）间接不定芽诱导的最适配方为MS+3.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA,不定芽诱导率达80%,不定芽数37个/外植体;（3）间接不定芽伸长的最适培养基配方为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA,在黑暗条件下培养,伸长率达到95.56%,平均不定芽高度为4.83 cm。（4）直接不定芽体系和间接不定芽体系中较佳的不定根诱导培养配方为1/2 MS+3 mg·L-1IBA,不定根诱导率可达96.67%,平均生根数量达到13.13条,移栽成活率达96.67%。通过‘巴厘’菠萝间接途径,继而研究了影响‘巴厘’菠萝遗传转化效率的诸多因素,初步建立了‘巴厘’菠萝稳定遗传转化体系,结果表明:抑菌抗生素选用浓度为300 mg·L-1的头孢霉素（Cephalosporins）;添加200μmol·L-1乙酰丁香酮（Acetosyringone）在侵染和共培培养基中能显著提高转化效率;适宜的农杆菌菌液浓度(OD600=0.7)、侵染时间为2 h、共培养时间为3 d均能有效地提高菠萝抗性愈伤率;采用分步筛选方案,10 mg·L-1的潮霉素（Hygromycin B）为极限筛选浓度,获得菠萝抗性芽苗。GUS组织化学染色观察,发现GUS在愈伤组织和愈伤分化出的芽苗均有表达。将‘巴厘’菠萝遗传转化体系应用于基因编辑,运用CRISPR/Cas9技术,对Ac ACL进行敲除编辑,PCR检测结果表明用于定点敲除Ac ACL1的载体序列已成功整合到菠萝基因组上。
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