猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）能够引起猪群发热、呼吸困难及母猪繁殖障碍等临床症状,给我国养殖业带来巨大损失。N蛋白是PRRSV的核衣壳蛋白,参与病毒基因组复制及病毒粒子组装等过程。本实验室前期发现N蛋白105及120位Ser存在磷酸化修饰。为阐明该修饰对PRRSV的影响,本研究探究了 N蛋白磷酸化位点突变与PRRSV复制及致病性的关系,筛选N蛋白与肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages,PAMs）的互作蛋白,为阐明N蛋白功能及其在PRRSV致病分子机制中的作用提供研究基础。本研究首先从N蛋白磷酸化位点突变影响PRRSV复制入手。将N蛋白105和120位Ser突变为Ala,结果表明突变病毒A105-120在Marc-145的复制速率与最终滴度显著低于亲本病毒 XH-GD（PA105＜0.01,PA120＜0.01,PA105-120＜0.01）。然而在PAM细胞中,A105-120感染后12-36 h复制速率低于XH-GD,但两者最终滴度无显著差异。使用RT-PCR分析各毒株感染PAMs中的亚基因组表达量,突变毒的基因组RNA（Genome RNA,gRNA）（P＜0.05）、亚基因组RNA（Subgenome RNA,sgRNA）2 和 sgRNA3 表达量显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,但短链sgRNA4和sgRNA5表达量随感染时间增多（P＜0.01,P＜0.05）。这说明,N蛋白磷酸化位点突变能够影响PRRSV在PAMs中的复制和亚基因组转录。病毒在宿主中复制速率是影响其致病性的关键因素之一。本研究针对N蛋白磷酸化位点突变影响PRRSV仔猪致病性进行分析。结果表明,相比亲本毒XH-GD,突变毒株A105-120感染仔猪的临床症状和肺脏损伤较轻微。XH-GD感染组6头仔猪全部出现高热（＞40.5℃）,死亡率为50%,而A105-120感染组仅2头仔猪出现高热,死亡率为16.67%。A105-120组仔猪体重稳步增长,攻毒后的9-18天显著高于XH-GD组（P＜0.001）。仔猪感染后3-7天血清病毒载量（P＜0.001）以及感染后7天和14天的肺脏和淋巴结组织病毒载量（P＜0.001）结果表明A105-120体内复制显著低于XH-GD。这说明,N蛋白磷酸位点突变影响了 PRRSV对仔猪致病性。病毒介导宿主细胞的生命过程也是影响其致病性的关键因素之一。本研究使用Label-Free非标记定量蛋白质组学技术对感染仔猪肺脏灌洗液中的蛋白进行鉴定及差异分析,分析N蛋白磷酸化位点突变影响PRRSV致病性的潜在分子机制。共鉴定到1941个蛋白可用于差异蛋白表达分析。将2倍差异蛋白进行GO、KEGG以及PPI分析发现,XH-GD及A105-120感染均导致大量差异蛋白富集在天然免疫、免疫调控、内质网蛋白加工及多种代谢过程中,但两者感染前后差异蛋白主要集中在天然免疫及免疫调控中,涉及膜信号转导、纤维蛋白生成以及补体激活等生物学过程。进一步使用转录组学手段针对亲本毒株以及突变病毒感染仔猪的肺泡巨噬细胞的差异基因进行鉴定,分析潜在信号转导机制差异。共鉴定到15746个基因用于差异分析。XH-GD感染组相比A105-120,上调基因主要富集在NF-κB、MAPK以及TNF信号转导等炎症及免疫相关通路中;下调基因主要富集在细胞紧密连接及ECM受体相互作用等。突变病毒体外感染PAMs中,P65磷酸化和IκB降解分析表明A105-120感染后诱导的NF-κB激活弱于XH-GD,且感染细胞中炎性因子IL-1β（P＜0.01）、IL-6（P＜0.05）、IL-8（P＜0.05）以及 TNF-α（P＜0.01）的表达低于XH-GD。这说明,该突变能减弱PRRSV介导的NF-κB激活及炎性因子表达。蛋白质之间的相互作用是宿主生命活动的基础,但PRRSV N蛋白与PAM细胞的互作蛋白缺乏研究鉴定。本研究使用酵母双杂交技术,构建了 PAM细胞cDNA文库pGADT-PAM,以PRRSV XH-GD株N蛋白序列构建诱饵载体pGBKT7-ORF7,通过诱饵毒性试验、自激活检测及结合生长筛选,经测序分析后获得18个候选互作蛋白,其中15个候选互作蛋白未在PRRSV相关研究中报道。使用siRNA发现RPL23、UBR5、TERF2IP/Rap1、PCBP1、ESRRG、SFPQ、FTH1 以及 AIF1基因表达沉默能显著影响PRRSV感染Marc-145细胞中Nsp9基因的表达。构建真核表达质粒 pcDNA3.1-PCBP1、pcDNA3.1-TERF2IP/Rap1、pcDNA3.1-AIF1、pcDNA3.1-RPL23以及pcDNA3.1-FTH1,外源性候选互作蛋白均能与N蛋白共定位,且PCBP1、TERF2IP/Rap1以及FTH1过表达后均能促进PRRSV在Marc-145细胞中复制,RPL23以及AIF1过表达后均能抑制PRRSV的复制。另外,在酵母双杂交系统中验证了 N蛋白与TERF2IP/Rap1存在蛋白互作,说明PRRSV可通过N蛋白与TERF2IP/Rap1互作从而促进自身复制。PRRSV感染导致的免疫抑制对疫苗开发提出了巨大挑战,急需新的抗病毒策略。本研究针对人参皂苷Rg1是否在体内外均具有抗PRRSV的作用,及其抗病毒分子机制进行了研究。结果表明,Rg1的细胞毒性较小,在Marc-145和PAM细胞中均能抑制不同分支的Ⅱ型PRRSV复制。Rg1可从病毒吸附、复制以及释放这3个阶段抑制病毒复制。同时,Rg1能够降低PRRSV感染的Marc-145细胞及PAM细胞中IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α的表达,抑制PRRSV感染介导的p65磷酸化和IκB降解。通过检测mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平发现Rg1通过激活mTOR减弱PRRSV对mTOR信号转导的抑制作用。使用嘌呤霉素标记新生多肽发现,Rg1能激活mTOR从而减弱PRRSV感染引起的宿主翻译关闭,且该作用呈剂量依赖性。Rg1还能降低PRRSV感染Marc-145细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达及自噬相关基因ATG5、ATG7和Beclin1的基因表达,这表明Rg1可减弱PRRSV感染引起的自噬。动物实验结果表明,4周龄仔猪感染HP-PRRSV JXA1后使用Rg1注射治疗,能显著降低仔猪在攻毒7天时的临床症状以及肺脏病变打分（P＜0.05）,且能够显著延长病程,攻毒对照组仔猪在11 dpi存活率为0%,而Rg1治疗组在14 dpi仔猪存活率为40%。荧光定量PCR结果表明,Rg1治疗组的血清病毒载量（7dpi,P＜0.05;10dpi,P＜0.01）和组织病毒载量（肺脏、淋巴结、胸腺）均显著低于对照组。表明,人参皂苷Rg1能有效减低PRRSV对仔猪致病性,是一种潜在的防控PRRSV的天然化合物。综上所述,本研究发现将N蛋白105及120位Ser突变为Ala能影响PRRSV在PAM细胞中的复制及亚基因组转录和对仔猪致病力。通过蛋白质组学结合转录组手段初步解析了该突变影响PRRSV致病性的潜在分子机制。针对N蛋白与PAMs的互作蛋白进行了筛选,初步验证候选互作蛋白对PRRSV复制的影响,并在酵母双杂交系统中验证N蛋白与TERF2IP/Rap1存在蛋白互作。最后,利用体外实验研究了人参皂苷Rg1抗PRRSV的效力以及抗病毒作用机制,并利用动物实验初步评价Rg1对PRRSV的体内治疗效果。本研究为揭示N蛋白磷酸化在PRRSV致病机制中的作用提供研究基础,也为使用中药作为PRRSV抗病毒新策略提供理论支撑和临床数据。