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目的:阿尔茨海默病(AD)是导致老年期痴呆的主要疾病构成之一,因其病因和病理机制迄今为止尚未得到充分的阐明,早期诊断和早期防治等领域的困难仍是阻碍全球狙击其快速增长的主要原因。其中,探索早期诊断实验室标志物并构建一个同时具备高敏感度和高特异度的诊断和鉴别诊断体系可能是破解这一困境的关键。考虑到Aβ级联学说在Aβ疫苗研究的纷纷受挫,以及另一个AD病理标志物-神经纤维缠结早期主要出现在细胞内,而另一种同为神经纤维骨架蛋白成分的神经丝蛋白轻链(NFL)很可能在AD病理积累过程中早期暴露在可检测的细胞外液中,为此,本课题拟采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测AD患者、血管性痴呆(VaD)患者以及不同年龄段认知功能正常人(NC)的脑脊液(CSF)和血浆中NFL浓度,并分别采用免疫印迹法(WB)和免疫组织病理染色(ICH)两种方法分别证实并分析。方法:(1)分组:将71名年龄1~90岁的研究对象按照疾病诊断分为3组:AD组19名,VaD组7名,NC组45名;(2)标本采集:常规收集所有研究对象的相关人口资料、临床资料、神经影像学和认知神经心理学检查资料后,清晨空腹采集全血2ml至加有EDTA抗凝剂的试管中,离心后制备成血浆标本。部分患者和NC组则在知情同意的情况下,经常规消毒和局部麻醉行腰椎穿刺术,抽取2ml的脑脊液,分装后统一储存在-80℃冰箱;(3)实验方法:(1)ELISA定量测定NFL浓度:根据SEEO38Hu 96T试剂盒和IBL international试剂盒说明书,分别检测上述所有血浆和脑脊液标本中的NFL浓度;(2)免疫印迹法(WB)定性分析血浆和脑脊液的自身抗NFL抗体:首先将血浆和脑脊液标本ELISA检测到的NFL浓度按四分位划分法重新分为四个亚组(NFL浓度<25%组,NFL浓度25%~50%组,NFL浓度50%~75%组,NFL浓度>75%组),随后采用纯化的牛源脊髓NFL蛋白(产品代码62008)作为电泳蛋白和目标抗原,并随机选取NFL浓度<25%和>75%的血浆(共24例)和脑脊液(共16例)作为识别抗体,同时设置多克隆抗NFL抗体(产品代码PAB12120)为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照,免疫化学荧光显影后分析自身抗NFL抗体(nAb-NFL)的免疫特性。(3)免疫组织病理染色法(ICH):随机抽取上述ELISA检测结果的四分位划分法NFL浓度分别在<25%、>75%的血浆和脑脊液标本作为一抗,以山羊抗人IgG为二抗,分别观察其对组织源性的Tg2576小鼠切片中的NFL抗原的免疫识别情况。结果:1.ELISA检测结果1.1血浆NFL检测结果:血浆NFL浓度按高低排序分别为VaD组、AD组和NC组(F=11.71,P=0.000);亚组分析显示,VaD组和AD组明显高于NC组,差异有统计学意义(t=4.132,P=0.000;t=2.079,P=0.081),但VaD组与AD组间比较差异无统计学意义(t=0.878,P=0.410)。1.2脑脊液NFL检测结果:脑脊液NFL浓度按高低排序分别为VaD组、AD组和NC组(F=16.338,P=0.000);亚组分析显示,VaD组和AD组明显高于NC组,差异有统计学意义(t=32.116,P=0.000;t=4.130,P=0.009),但VaD组与AD组间的差异无统计学显著性意义(t=1.844,P=0.122)。1.3血浆和脑脊液NFL浓度的年龄相关性自然变化规律:(1)不同年龄段NC组血浆NFL浓度存在显著性统计学差异(F=5.807,P=0.000),并呈现出一个整体先抑后扬的曲线上升趋势,回归分析显示,年龄对NC组的血浆NFL浓度的决定系数为0.332;(2)不同年龄段NC组脑脊液NFL浓度呈现出与外周血相似的年龄相关性曲线上升的趋势:各年龄组间的差异达到显著性统计学意义(F=3.015;P=0.047),而年龄决定系数为0.297。本研究还显示血浆和脑脊液中的NFL浓度在年龄相关的自然变化规律中均从中年开始进入稳步升高的阶段。1.4疾病组血浆和脑脊液中NFL浓度与人口资料和临床变量的相关性分析:两组患者的年龄、疾病病程、教育程度、MMSE得分、血浆S100B水平与血浆和脑脊液中的NFL浓度均未发现有统计学显著性意义的关联和差异(P>0.05)。2、免疫印迹法(WB)研究结果:2.1按照1:2比例随机抽取24例血浆样本(其中NFL浓度<25%组11例,NFL浓度>75%组13例)进行免疫印迹分析,结果发现:9例(9/24,37.5%)血浆能识别标准NFL蛋白(62008),其中低浓度组1例(1/11,9.09%);高NFL浓度组8例(8/13,61.5%)。Fisher精确概率分析证实,两组间nAb-NFL阳性检出率存在统计学显著性差异(P=0.013)。将免疫印迹结果再进行疾病分组分析发现:NC组的nAb-NFL阳性率(1/11)明显低于AD组(7/8)和VaD组(1/1)(X~2=11.67;P=0.003)。2.2采用同样的分组和实验方法分析16例脑脊液标本(其中NFL浓度<25%组9例,NFL浓度>75%组7例)发现;低浓度组检出4例(4/9,44.44%),而高浓度组检出7例(7/7,100%),两组间的阳性率有统计学显著性差异(P=0.034)。将免疫印迹结果再进行疾病分组分析发现:NC组nAb-NFL阳性率(4/9)明显低于AD组(5/5)和VaD组(2/2)(X~2=7.509;P=0.023)。3、免疫组织病理染色法(ICH)研究结果:AD患者血浆和脑脊液可识别Tg2576小鼠脑组织切片的神经轴突。结论:1、NFL浓度在血浆和脑脊液中存在着较高的一致性,可以作为痴呆诊断的生物学标志物之一,但难以成为痴呆病因的鉴别诊断指标。2、血浆和脑脊液中的NFL水平在认知正常人群中均呈现出一个极为相似的年龄相关性曲线上升趋势,中年阶段是两者变化的关键节段。3.nAb-NFL抗体普遍存在于所有研究对象中的外周血和脑脊液中,并高发于痴呆人群,具备一定的痴呆诊断生物学标志物潜质。