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鹿茸角是雄性梅花鹿的第二性征,它是哺乳动物中唯一可再生器官,在快速生长期,其顶端增殖区的细胞分裂速度是肿瘤细胞分裂速度的近30倍,这样的速度是其他哺乳动物组织和器官所无法比拟的,鹿茸组织的细胞增殖、分化、凋亡受到特定基因的表达调控,但迄今仍无法从根本上阐明鹿茸生长的生物学调控机制。 本试验以东北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)鹿茸尖端间充质组织为材料,以对多种恶性肿瘤细胞起着重要调节作用的膜联蛋白基因为研究对象,用RT-PCR技术克隆出包含膜联蛋白A1(Anxa-1)基因与膜联蛋白A2(Anxa-2)基因全部编码区的cDNA序列,并运用生物信息学方法及实时荧光定量技术对这两种基因的氨基酸序列及不同生长时期的表达情况进行了分析。主要研究结果如下: 1、东北梅花鹿鹿茸Anxa-1和Anxa-2基因cDNA克隆及生物信息学分析 Anxa-1与Anxa-2基因序列测序长度分别为1059bp和1180bp,分别编码346个氨基酸和339个氨基酸。经生物信息学分析,Anxa-1和Anxa-2基因编码蛋白均为稳定蛋白;相对分子质量分别为38830.4和38612.0;理论等电点分别为6.17和6.92; Anxa-1蛋白一级结构中亮氨酸占最大比例为10.4%,Anxa-2蛋白一级结构中亮氨酸与赖氨酸占最大比例为10.0%; Anxa-1和Anxa-2蛋白均不具备信号肽,不属于分泌蛋白;Anxa-1蛋白亚细胞定位于细胞质,Anxa-2蛋白亚细胞定位于细胞核;通过对Anxa-1和Anxa-2蛋白的二级结构预测,发现这两种蛋白质空间结构均由α-螺旋、无规则卷曲、扩展链三部分组成,并成功构建了这两种蛋白质的三维结构。分别对这两种蛋白质氨基酸序列进行多重序列比对,发现这两种基因在不同物种间保守性较高,推测其在不同物种间功能相似,通过构建系统进化树,发现这两种基因在进化中分为两支,一支为哺乳动物类,一支为鸟类,说明这两种基因均由共同祖先基因进化而来,是重要的功能基因。 2、鹿茸不同生长时期Anxa-1和Anxa-2基因实时荧光定量结果分析 实时荧光定量PCR结果显示:这两种基因均在鹿茸不同生长时期表达存在差异,其中Anxa-1基因在鹿茸的生长前期表达量高于中期与后期;Anxa-2基因在鹿茸的生长中期表达量高于前期与后期。