多杀菌素高产菌株的诱变选育及快速筛选方法的研究

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刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后可产生一种杀虫活性高、选择性高、对非靶标动物安全的新型微生物源杀虫剂多杀菌素。本文根据多杀菌素的优异特性,选取蚊子幼虫作为靶标动物建立基于活体筛选的多杀菌素高产菌株高通量快速筛选方法,并分别对多杀菌素产生菌ASAGF73进行物理化学诱变,旨在获得适合多杀菌素工业化生产的高产菌株。利用多杀菌素对蚊子幼虫致死率与多杀菌素浓度的相关性,通过比较蚊子幼虫的致死率筛选出多杀菌素产量较高的菌株。结果表明,2龄埃及伊蚊幼虫具有高的敏感性和精确性,生物检测曲线拟合获得的毒力回归方程标准误差SE较小,最适宜作为供试虫源用于快速初筛方法。最终选取对2龄蚊子幼虫处理时间1小时蚊子幼虫致死率90%以上的突变株进行复筛。以菌株ASAGF73为出发菌株,通过不同时间不同剂量亚硝基胍(NTG)进行诱变,并利用96孔板发酵培养结合生物检测快速方法进行高通量筛选。从1920株突变株中筛选获得遗传稳定高产突变株8株,多杀菌素发酵产量比出发菌株分别提高了43.94%、33.76%、29.41%、28.61%、27.40%、26.42%、25.59%和20.40%。通过2次常温室压等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变,初步构建了ARTP诱变选育多杀菌素高产菌株模型,在电源功率100W,照射距离2mm,等离子体的温度<30℃,气流量10L/min的条件下,照射时间10-270s突变株致死率介于8%-99%之间,最佳诱变条件为240s。以菌株ASAGF73为出发菌株,通过ARTP诱变,并利用96孔板发酵培养结合生物检测快速方法进行高通量筛选。从960株突变株中筛选获得遗传稳定高产突变株6株,多杀菌素发酵产量比出发菌株分别提高32.29%、25.67%、24.50%、24.32%、23.96%和21.83%。
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