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骨质疏松症及相关的骨折是全球性中老年妇女死亡率和致残率升高的重要原因,随着世界人口的老龄化,骨质疏松症将成为前所未有的公共卫生问题。
雌激素撤退与绝经后骨质疏松症有(PMOP)密切关系,但是雌激素替代治疗在防治骨质疏松症的同时,明显增加了心脏疾患、中风及乳腺癌的发病率。应运而生的雷洛昔芬(RLX)等选择性雌激素受体调节剂(SERM),与雌激素相比,对心脏、乳腺的副作用明显降低。但是,近年的临床病例研究提示雷洛昔芬可能与恶性混合性苗勒氏管肿瘤及子宫出血的发生有关。目前对于雌激素和雷洛昔芬治疗骨质疏松症的确切机制尚不明确。因此深入探讨SERM类药物的作用机制,寻找新的组织选择性更高的药物成为亟待解决的问题。本研究以雷洛昔芬和17β-雌二醇(17β-E<,2>)为药物刺激因子,观察p38MAPK信号通路在成骨细胞(OBs)增殖、分化和凋亡中的作用,旨在研究雷洛昔芬和17β-雌二醇是否在p38MAPK信号通路中存在不同,为新的骨质疏松症防治药物的研发提供理论基础。
第一部分 p38MAPK在小鼠成骨细胞增殖和分化中的作用
目的:探讨p38MAPK信号转导通路在成骨细胞增殖和分化过程中的作用。
方法:取第一继代BALB/c小鼠头盖骨来源的成骨细胞,药物刺激组分别加入不同浓度17 β-雌二醇或雷洛昔芬;含阻断剂组预先添加不同浓度的SB202190阻断p38MAPK信号转导通路后,再加17 β-雌二醇或雷洛昔芬;另设对照组。72小时后用MTT法和细胞周期测定法检测成骨细胞的增殖能力;PNPP法和RT-PCR法检测成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达水平。
结论:17 β-雌二醇和雷洛昔芬能够通过p38MAPK信号通路,促进小鼠成骨细胞的增殖和分化。
第二部分 p38MAPK在小鼠成骨细胞凋亡中的作用
目的:探讨p38MAPK信号通路对小鼠成骨细胞凋亡的影响。
方法:酶消化法原代培养小鼠成骨细胞,取第一继代成骨细胞并分组加药:含药物组加入17 β-雌二醇(10<-8>M)或雷洛昔芬(10<-7>M);含阻断剂组预先添加SB202190(终浓度10 μM),阻断p38MAPK信号转导通路后,再加入17 β-雌二醇(10<-8>M)或雷洛昔芬(10<-7>M);另设对照组。无血清培养法诱导成骨细胞早期凋亡。Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪分析细胞早期凋亡。
结论:17 β-雌二醇和雷洛昔芬能够抑制成骨细胞的无血清凋亡;p38MAPK信号通路对成骨细胞的凋亡无明显影响。
第三部分p38MAPK对小鼠成骨细胞内Col I α<,1>、TSP2、OPG和RANKL表达的影响
目的:探讨p38MAPK信号通路对成骨细胞内Col I α<,1>、TSP2、OPG和RANKI表达的影响。
方法:取第一继代BALB/c小鼠头盖骨来源的成骨细胞,药物刺激组分别加入17 β-雌二醇(10<-8>M)或雷洛昔芬(10<-7>M);含阻断剂组预先添加SB202190(终浓度20 u M)阻断p38MAPK信号转导通路后,再加17 β-雌二醇或雷洛昔芬;另设对照组。72小时后收集细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR法检测细胞内Ⅰ型胶原α<,1>链(ColIα<,1>)、血小板反应蛋白2(TsP2)、骨保护素(OPG)和核因子K B受体(RANKL)的表达水平。
结论:17 β-雌二醇或雷洛昔芬能够促进成骨细胞内TSP2、OPG和RANKL的表达,对OPG/RANKL无明显影响;p38MAPK信号转导通路在Col α<,1>、TSP2、OPG、RANKL和OPG/RANKL的表达中发挥重要作用,这可能是其调控成骨细胞增殖、分化的机制之一。