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新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种高度接触性、急性、烈性和败血性的禽类传染病,对全球养禽业造成了巨大的损失。目前一般使用活疫苗和灭活疫苗对新城疫进行免疫预防控制,然而,在世界各地的商品鸡群中,依旧存在新城疫爆发的状况,表明现有的常规疫苗存在缺陷,因此,新型疫苗的研发势在必行。本研究利用毕赤酵母表达系统表达NDV F48E8病毒株的F基因,与从鼠伤寒沙门菌表面提取的鞭毛蛋白FliC混合,通过小鼠模型初步验证FliC的免疫佐剂效应；此外,将FliC与商品化鸡低毒力活疫苗(LaSota株)联合免疫SPF鸡并进行攻毒实验,探索FliC作为新城疫低毒力疫苗佐剂的可行性,从而为FliC作为新城疫疫苗佐剂的研究奠定基础。1.鞭毛蛋白作为新城疫亚单位疫苗佐剂的研究通过PCR扩增NDV F48E8病毒的F基因,大小为1659bp,再与毕赤酵母表达载体pPICZaA连接,将鉴定正确的重组质粒电转化进毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组菌GS115(pPICZaA-F)。重组菌的最佳诱导条件为：使用终浓度为0.5%(V/V)甲醇于28℃、250rpm的条件下连续诱导3天,SDS-PAGE显示,F蛋白大小约为72KD,主要存在于胞内。Western blotting结果显示,F蛋白能够与小鼠抗NDV F48E8多抗血清和小鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应,表明F蛋白具有良好的免疫反应性。本研究采用酸裂解法从本实验室构建保存的沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-flic-WT)中提取鞭毛蛋白FliC。将其腹腔免疫C3H/HeJ小鼠,通过qRT-PCR检测不同时间点脾脏中TLR5和不同细胞因子mRNA的相对表达水平。结果显示,注射FliC1h和6h后,TLR5分子的mRNA水平分别上调了117和293倍(p<0.05)。在注射FliC后的不同时间点,促炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β以及IFN-y、IL-12、IL-8均有不同程度的上调,而抑炎性细胞因子IL-10无显著上调(p>0.05)。为检测FliC作为佐剂的效果,将F蛋白与FliC混合后免疫C3H/HeJ小鼠,结果发现,F+F1iC蛋白组的IgG2a水平显著高于IgG1(p<0.01)。用F蛋白刺激各免疫组小鼠的脾脏淋巴细胞后发现,F+FliC蛋白组的IFN-γ水平显著高于IL-4(p<0.001),而且F+FliC免疫组的IFN-γ含量显著高于单独F蛋白组(p<0.01),说明免疫应答类型偏向于Thl型,与IgG亚型检测结果一致。通过检测二免6周内各免疫组抗体水平动态变化发现,F+FliC免疫组和F+Al(OH)3免疫组抗体水平均在第21天达到最高,与单独F蛋白组有显著差异(p<0.01),之后开始下降,抗体能维持1个月左右。表明鞭毛蛋白FliC作为佐剂可促进机体的天然免疫应答和获得性免疫应答水平。2.鞭毛蛋白与鸡新城疫低毒力活疫苗联合应用的研究本研究将鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC与商品化鸡新城疫低毒力活疫苗(LaSota株)混合后滴鼻免疫1周龄的SPF鸡发现,FliC可以显著提高NDV特异性的IgG抗体和HI抗体水平(p<0.05)。用NDV F48E8攻毒后,PBS组的鸡于第6天全部死亡,而LaSota+FliC组和LaSota疫苗组的鸡全部存活,因此本研究建立了基于NDV F48E8F基因的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法,用于检测攻毒后各组的排毒状况。结果发现攻毒后第3天的喉头处以及攻毒后第5天的泄殖腔处,LaSota+FliC组的NDV病毒含量均显著少于单独LaSota疫苗组(p<0.05),其余各个时间点,无论是喉头处还是泄殖腔处,LaSota+FliC组的NDV病毒含量也略低于单独LaSota疫苗组,说明LaSota疫苗与FliC联合免疫有助于抑制病毒在上呼吸道和肠道的复制和排毒。上述结果表明鞭毛蛋白作为LaSota疫苗的佐剂,可增强机体的体液免疫应答以及疫苗的保护效率,从而有助于抵抗新城疫强病毒的攻击。本研究为鞭毛蛋白作为鸡疫苗佐剂的深入研究奠定了基础。