【摘 要】
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大量研究已经证实人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）的感染与宫颈癌的发生发展密切相关。HPV疫苗能有效预防HPV感染进而减少宫颈癌的发生。已上市HPV疫苗均基于HPV衣壳蛋白L1自组装的病毒样颗粒（virus like particle,VLP）研发。该疫苗免疫保护性高,且能在接种后较长时间维持免疫保护效果。但L1-VLP疫苗仅能保护疫苗组分包含的型别,交叉保护性弱,如
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大量研究已经证实人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）的感染与宫颈癌的发生发展密切相关。HPV疫苗能有效预防HPV感染进而减少宫颈癌的发生。已上市HPV疫苗均基于HPV衣壳蛋白L1自组装的病毒样颗粒（virus like particle,VLP）研发。该疫苗免疫保护性高,且能在接种后较长时间维持免疫保护效果。但L1-VLP疫苗仅能保护疫苗组分包含的型别,交叉保护性弱,如何增加HPV疫苗的免疫保护范围是下一代HPV疫苗研究的重点方向之一。目前扩大HPV保护型别的策略有增加L1-VLP疫苗包含型别、抗原表位替换、L2蛋白表位展示等。本研究从HPV L1蛋白的组装入手,期望利用不同型别的L1五聚体共同组装成具有多种型别L1表位的杂合VLP单颗粒（capsomere-hybrid virus-likepartical,chVLP）,实现更多型别的保护。在前期的工作中我们已经建立了系统的杂合颗粒组装方法,并初步在小鼠模型中评价了两型杂合颗粒的免疫原性。但杂合颗粒的稳定性和组装机制尚不清楚,杂合颗粒是否可以容纳更多型别的L1五聚体也需要进一步研究。在本研究中,选择HPV33五聚体和HPV58五聚体研究杂合颗粒的稳定性和组装机制。首先成功构建了 chVLP-a:HPV33L1-C175A-HPV58L1-C428A 及chVLP-b:HPV58L1-C175A-HPV33L1-C428A的双型杂合颗粒,并通过蛋白免疫印迹、高效液相色谱、动态光散射、差示扫描量热等方法分析颗粒性质,发现其与两种对照野生型（HPV33 VLP和HPV58 VLP）的形态和均一性相当,随后对杂合颗粒进行三个保存温度、为期四周的持续观察,结果显示两种不同形式的杂合颗粒存在差异,杂合颗粒chVLP-b物理性质较为稳定,与对照的两种野生型相似,但是第四周的chVLP-a的颗粒负染形态较差;在真核表达系统中确定了最优转染效率的质粒比例为L1C175A:L1C428A:EGFP=5:5:10,随后大量制备了 HPV33 和 HPV58 的杂合假病毒颗粒（capsomere-hybrid pseudovirus,chPsV）,并解析了其与HPV58型特异抗体A12A3 Fab复合物冷冻电镜结构,发现与chPsV结合的Fab密度与在HPV58 VLP:A12A3 Fab抗体复合物中结合HPV58 VLP的Fab密度相当;将杂合颗粒组装型别扩大到九种,构建了两种九型杂合颗粒chVLP-1:HPV16/18/31/45-C175A-HPV6/11/33/52/58-C428A,chVLP-2:HPV6/11/33/52/58-C175A-HPV16/18/31/45-C428A),免疫原性分析结果表明:chVLP-2 对九种组装型别HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58的免疫原性与九种野生型混合VLP疫苗以及目前已经上市的Gardisil9相当,并存在微弱的三种非组装型别HPV26/35/53交叉免疫原性。chVLP-1对HPV33无免疫原性,对于其余8种组装型别的免疫原性与对照组相当,存在微弱的HPV35/39/53/59交叉免疫原性。综上,本研究基于对HPV突变L1蛋白五聚体间的杂合组装分析了双型杂合颗粒的稳定性、五聚体分布以及九型杂合颗粒的免疫原性。通过实验探究出双型杂合颗粒具有较为稳定的物理性质,解析了 12.24 （?）的杂合假病毒和A12A3 Fab免疫复合物结构,并且发现九型杂合颗粒能够诱导机体产生与商品化疫苗相似的中和抗体滴度,这为新一代更广谱的HPV疫苗研发提供了思路和参考。
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