研究背景:临床研究表明雌激素参与女性的情绪调节。在更年期过渡期间,卵巢雌激素分泌减少会导致情绪障碍,其中焦虑和抑郁是更年过渡期出现的主要症状。Mulhall等人的研究表明,与绝经前相比,围绝经期和绝经后阶段女性往往伴随有焦虑和抑郁症状的增加。一项多中心的横断面研究表明,抑郁情绪与绝经后体内雌激素水平的降低显著相关。动物研究也同样证实雌激素水平对情绪行为具有重要影响。在发情周期的间情阶段,低水平的雌激素导致啮齿类动物出现抑郁样行为。卵巢切除术导致的雌激素缺乏会导致大鼠产生抑郁样行为。此外,4-乙炔-环己烷氧化物引起的卵巢功能衰竭往往会导致焦虑行为的出现。在大鼠的幼年发育阶段和绝经期雌激素下降阶段,雌二醇对雌性大鼠的情绪和精神行为的正常维持起着十分关键的作用。有研究表明,雌激素替代可减少老年雌性大鼠的焦虑和抑郁行为,提高认知能力。临床和临床前研究也表明,雌激素替代治疗具有抗抑郁作用。值得注意的是,长期应用雌激素可能会引起一些严重的副作用,包括动脉粥样硬化、乳腺癌和其他癌症的风险增加。因此,研究和寻找一种安全的治疗抑郁症和焦虑的方法显然很有意义。白藜芦醇是一种由葡萄和其他一些植物的表皮产生的天然酚类物质,同时也是沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1,SIRT1)受体的激活剂。越来越多的证据表明白藜芦醇可能对情绪障碍有治疗作用。白藜芦醇可减轻慢性糖皮质激素暴露引起的抑郁样行为和代谢紊乱。我们前期研究发现,白藜芦醇预处理小鼠2周,能有效改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的小鼠的抑郁样行为。此外,白藜芦醇还能抑制高脂饮食引起的小鼠焦虑样行为。已有研究显示,雌激素缺乏可导致海马齿回(dendate gyrus,DG)小胶质细胞过度激活和促炎细胞因子的过度分泌,进而抑制海马神经发生,并参与抑郁样行为的发生。白藜芦醇能否抑制由雌激素缺乏引起的DG神经炎症和神经发生异常,进而改善抑郁和焦虑行为,目前尚不清楚。鉴于雌激素水平下降与焦虑和抑郁行为的相关性,及炎症引起海马神经发生的抑制是介导抑郁样行为发生的病理改变之一。且白藜芦醇对LPS诱导神经炎症所致的抑郁样行为具有显著的改善作用,我们推测:卵巢切除术所致的焦虑和抑郁样行为可能与海马的神经炎症和神经发生异常有关,白藜芦醇可能通过激活其经典的Sirt1通路,调控NLRP3炎症小体以及海马炎症反应和神经发生对小鼠焦虑和抑郁样行为产生治疗作用。研究方法:雌性C57BL/6J小鼠(6-8周龄,17-20 g)进行卵巢切除术。术后用白藜芦醇进行治疗,使用剂量为20mg/kg,持续注射2周,对照组给予等量二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)。实验分为以下4组:(i)假手术+溶剂组,(ii)卵巢切除+溶剂组,(iii)假手术+白藜芦醇组,(iv)卵巢切除+白藜芦醇组。采用行为学方法检测小鼠的焦虑样和抑郁样行为以及白藜芦醇的治疗作用。采用溴代去氧吡啶(bromodeoxyuridine,BrdU)标记来评估海马齿状回的细胞增殖情况。采用免疫组化和RT-PCR检测小鼠海马区小胶质细胞激活和细胞因子的变化,蛋白免疫印迹检测Sirt1蛋白水平的变化。研究结果:1.白藜芦醇和卵巢切除对小鼠体重、血清雌二醇浓度和子宫重量的影响(1)卵巢切除+溶剂组小鼠的体重明显高于假手术+溶剂组(p=0.011),白藜芦醇可使溶剂组和卵巢切除组小鼠体重明显减轻(卵巢切除+溶剂组vs卵巢切除+白藜芦醇组,p<0.01;假手术+溶剂组vs假手术+白藜芦醇组,p<0.01);(2)小鼠卵巢切除后小鼠雌二醇浓度水平显著下降,差异有统计学意义(p<0.01);(3)卵巢切除后的雌性小鼠子宫萎缩,子宫重量较正常对照小鼠显著减轻(p<0.01);2.白藜芦醇和卵巢切除对小鼠焦虑抑郁样行为的影响(1)开场实验可以检测小鼠的运动功能,中央时间可以反映小鼠的焦虑情况。研究发现,卵巢切除+溶剂组在旷场行为学检测中移动的距离明显少于假手术+溶剂组(p<0.01),中心时间明显缩短(p<0.01)。白藜芦醇干预后,去卵巢小鼠在旷场行为学检测中移动的距离显著升高(p=0.019),去势小鼠的总中心时间显著增加(p=0.015),提示焦虑样行为得到显著改善。上述研究提示藜芦醇的干预可缓解雌激素缺乏引起的焦虑样行为;(2)高架十字迷宫(high plus-maze,EPM)检测可评估小鼠的焦虑水平。研究发现,与假手术组小鼠相比,卵巢切除组小鼠在迷宫开臂的时间更短(p<0.01),进入开臂的比例更低(p<0.01),证实卵巢切除组小鼠出现焦虑样行为。白藜芦醇的干预显著提高了卵巢切除组小鼠进入开臂的时间百分比(p<0.01),但进入开臂频率的百分比的无显著变化(p=0.145);(3)明暗箱行为学测试为评估小鼠的焦虑程度的另一种行为学检测方法。研究发现,卵巢切除组小鼠较假手术组小鼠的暗箱时间明显增加(p<0.01),而白藜芦醇的干预可以有效降低卵巢切除组小鼠的暗箱时间(p=0.030),但对穿梭次数无显著影响(p=0.094);上述结果证实了白藜芦醇的干预可缓解小鼠雌激素缺乏引起的焦虑样行为;(4)悬尾行为学测试(Tail suspension test,TST)和强迫游泳行为学测试(Forced swimming test,FST)用于检测小鼠的抑郁程度。悬尾实验结果显示,与对照组相比,去卵巢的小鼠在悬尾测试中表现出更长的静止时间(p<0.01),而白藜芦醇干预可显著缩短去卵巢小鼠静止时间(p=0.020)。与悬尾行为学测试结果一致,强迫游泳结果显示,去卵巢小鼠的静止时间明显长于假手术对照组小鼠(p<0.01),白藜芦醇显著降低了去卵巢小鼠强迫游泳实验的静止时间(p<0.01);上述结果提示白藜芦醇的干预可缓解小鼠雌激素缺乏引起的抑郁样行为;(5)三箱社交行为学用于检测小鼠的社交行为。在三箱社交行为学测试中,正常社交行为表现为小鼠和物体间小鼠更偏向与小鼠交流。研究结果显示,卵巢切除和白藜芦醇干预对小鼠的社交能力无显著影响;(6)新物体识别(novel object recognition,NOR)行为学用于检测小鼠的认知功能,其中识别指数(Discrimination Index,DI)反映的是小鼠对新目标进行探索的时间与对熟悉目标进行探索时间之间的关系。研究发现,卵巢切除和白藜芦醇干预对小鼠的DI无明显影响(p=0.907),提示卵巢切除和白藜芦醇干预对短期记忆无显著影响。Y迷宫中的自发交替率被研究者用作检测空间工作记忆的指标。研究发现,卵巢切除和白藜芦醇干预对小鼠的自发性交替率无显著影响(p=0.982);3.白藜芦醇干预改善卵巢切除小鼠焦虑抑郁样行为的作用机制(1)海马神经发生异常与焦虑和抑郁样行为的发生密切相关。本研究采用BrdU标记及免疫组化染色分析小鼠海马齿状回神经干细胞的增殖。研究发现,卵巢切除和白藜芦醇干预对小鼠海马齿回神经干细胞的增殖无显著影响(p=0.406);(2)离子钙接头分子蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)为小胶质细胞标记。免疫组化结果显示,卵巢切除术后,小鼠海马齿状回的Iba-1阳性细胞数量较对照组显著增加(p<0.01),且小胶质细胞的形态主要为细胞体积较大,胞质致密的激活状态。经白藜芦醇干预后,激活态小胶质细胞的数量较卵巢切除组小鼠显著减少(p<0.05),提示白藜芦醇可抑制因雌激素水平下降导致的海马神经炎症;(3)NLRP3炎症小体和NF-κB为重要的炎症信号通路。研究发现,NLRP3和NF-κB的mRNA水平在卵巢切除组小鼠海马中的表达较对照组显著增加(p<0.01),而白藜芦醇干预可显著逆转该效应(p<0.05)。细胞因子IL-1β和IL-18参与了炎症的调节。研究发现海马IL-1β和IL-18的mRNA水平在卵巢切除后显著增加(p<0.05),而白藜芦醇干预后,可以阻断卵巢切除小鼠海马中IL-1β和IL-18 mRNA的升高(p<0.05)。神经炎症可导致海马神经元的凋亡,本研究发现,卵巢切除组小鼠海马组织中凋亡相关的caspase-1 mRNA水平显著高于对照组(p<0.05),白藜芦醇处理可阻断卵巢切除组的小鼠海马组织中caspase-1 mRNA的升高(p<0.05)。(4)白藜芦醇主要通过Sirt1介导其作用,研究发现,卵巢切除组小鼠海马Sirt1的mRNA水平较对照组显著降低(p<0.05),白藜芦醇干预可明显逆转了这一效应(p<0.05)。与荧光定量PCR结果一致,Western Blot检测证实了上述变化(p<0.01)。研究结论:(1)卵巢切除导致的雌激素水平下降可导致雌性小鼠出现焦虑和抑郁样行为,白藜芦醇处理可改善卵巢切除小鼠的行为学异常。(2)雌激素水平下降可显著激活海马小胶质细胞,导致小胶质细胞数量增加、细胞因子IL-1β、IL-18及炎症相关通路NLRP3炎性小体和NF-κB的显著升高,白藜芦醇处理可显著抑制海马小胶质细胞的激活。(3)白藜芦醇通过激活Sirt1通路抑制卵巢切除引起的小鼠海马内神经炎症反应。