一、RBM8A与人肝细胞癌相关性的临床初步研究目的:有研究显示RBM8A与恶性肿瘤的发生与发展具有密切相关性。然而,RBM8A与肝细胞癌的相关性尚未有明确报道。本研究旨在首先通过检测RBM8A在肝细胞癌组织、相关癌旁组织、肝血管瘤组织中的表达水平的差异,以及检测肝细胞癌患者与肝硬化患者、正常体检人群血清样本中RBM8A的表达差异,初步探讨RBM8A与肝细胞癌发生相关性、以及RBM8A的表达水平与肝细胞癌患者肿瘤学特征及者预后的相关性。分析将RBM8A作为肝细胞癌辅助诊断指标及预后预测指标的潜在可能性。方法:收集广西医科大学附属肿瘤医院2012年3月至2014年12月间经手术切除并经术后病理证实为肝细胞癌的组织105例,并收集相应距离肿瘤边缘2cm处的癌旁组织。另收集经手术切除并经术后病理证实为肝血管瘤的组织67例。运用qRT-PCR法、Western Blot法、免疫组织化学法检测并分析rbm8a的mrna及蛋白在肝细胞癌组织、相应癌旁组织、及肝血管瘤组织中的表达差异;根据rbm8a在肝细胞癌组织中的mrna含量及蛋白表达状况,将肝细胞癌患者分成高表达组与低表达组,初步分析rbm8a的表达量和肝细胞癌患者肿瘤学及临床特征的相关性;并根据免疫组织化学检测结果,运用kaplan-meier生存曲线法分析计算rbm8a低表达组与高表达组肝癌患者的无进展生存(progression-freesurvival,pfs)和总生存(overallsurvival,os)时间,并用log-rank检验两组间是否存在统计学差异,初步分析rbm8a的表达量和肝细胞癌患者预后的关系。另收集肝细胞癌患者、肝硬化患者及正常体检人群的血清标本各110例,运用elisa法联合检测上述人群血清中rbm8a、afp的表达差异,绘制roc曲线,根据cutoff值指示rbm8a+afp诊断hcc敏感度及特异性匹配最佳时的浓度值,分析联合检测rbm8a+afp对于提高诊断hcc敏感性及特异性的价值并将rbm8a作为肝癌辅助诊断指标的可行性。结果:(1)qrt-pcr显示:rbm8amrna在肝细胞癌组织中的平均表达量为△△ct=7.99595±5.49764,在癌旁组织中的平均表达量为△△ct=4.6667±3.78338,在肝血管瘤组织中的平均表达量为△△ct=1.6460±1.53852,结果显示rbm8amrna的表达情况为肝细胞癌组织>癌旁组织>肝血管瘤组织(p<0.05)。(2)免疫组化结果显示:rbm8a蛋白在肝细胞癌组织、癌旁组织、肝血管瘤组织中阳性率分别85%、61.67%、5.71%,结果显示rbm8a蛋白的表达情况为肝细胞癌组织>癌旁组织>肝血管瘤组织(p<0.0001);(3)westernblot结果显示:rbm8a在肝细胞癌组织中平均灰度值为ia(rbm8a)/ia(β-actin)=1.86±0.36;癌旁组织中平均灰度值为ia(rbm8a)/ia(β-actin)=1.35±0.32;肝血管瘤组织中平均灰度值为ia(rbm8a)/ia(β-actin)=0.95±0.35(p<0.05)。结果显示rbm8a蛋白的表达情况为肝细胞癌组织>癌旁组织>肝血管瘤组织(p<0.0001)。(4)将qrt-pcr与免疫组化检测结果与肝癌患者临床病特征进行分析:(1)rbm8a的蛋白表达水平与肿瘤直径、hbsag、tnm分期、edmondson病理分级呈正相关(p<0.05)。(2)rbm8a低表达组患者的总体os和dfs均较高表达组延长(p<0.05)。(4)qrt-pcr检测结果显示,以rbm8amrna在肝细胞癌组织中表达量为7.99595为界,105例肝细胞癌患者中85例为高表达(80.95%)。rbm8amrna含量高表达与hbsag(p<0.001)、edmondson病理分级(p=0.004)之间具有显著相关性;免疫组化检测结果显示,105例肝细胞癌组织中rbm8a表达为阳性的有92例(阳性率87.62%)。rbm8a蛋白表达的阳性率与hbsag(p<0.001)、肿瘤直径(p=0.013)、tnm分期(p<0.001)、edmondson病理分级(p=0.003)之间具有显著相关性。(5)免疫组化的结果显示,肝细胞癌患者中为rbm8a高表达组(强阳性及阳性)的有64例(60.95%),低表达组(弱阳性及阴性)的有41例(39.05%),低表达组患者和高表达组患者的rbm8a总体生存期(os)分别为229天和160天(p<0.001),两组患者的无进展生存期(pfs)分别为114天和90天(p<0.001)。结果表明rbm8a低表达组患者的总体生存期(os)和无进展生存期(pfs)均长于表达组患者。(6)elisa检测结果显示,肝细胞癌患者血清中rbm8a的蛋白表达水平明显高于肝硬化组和正常肝组织患者血清中rbm8a的蛋白表达水平;并且,单纯检测血清afp时,诊断肝癌的敏感性为70.0%,联合检测血清中rbm8a、afp时,诊断肝癌的明显提升为86.3%。提示联合检测血清中rbm8a及afp水平有助于提高诊断肝癌的敏感性,而对于提高诊断肝癌的特异性性则不明显促进作用。结论:rrbm8a的异常高表达可能与肝细胞癌的发生发展密切相关,并且rrbm8a具有作为诊断、筛查肝细胞癌辅助指标、预测肝细胞恶性程度及患者预后指标的潜在可能性。二、rbm8a与肝癌细胞增殖及凋亡特性的基础实验研究目的:在初步探讨rbm8a的表达水平与肝细胞癌肿瘤学特征及肝细胞癌患者预后的相关性的基础上,通过构建rbm8a低表达及过表达的细胞株,检测rbm8a低表达或过表达后肝细胞癌细胞的增殖能力、侵袭能力、凋亡能力及细胞周期的的变化,进一步探讨rbm8a基因对于肝细胞癌形成的有关生物学活动的影响。方法:(1)采用westernblot对一系列体外肝癌细胞株进行检测,选取rbm8a表达水平最高的细胞株,设计并筛选rbm8a干扰序列,构建敲低慢病毒和对照病毒,感染靶细胞;经qrt-pcr验证rbm8a敲低效率(敲低效率70%以上),建立稳定的转染rbm8a-kd细胞株,并建立空载rbm8a-nc细胞株作为对照;(2)采用westernblot对一系列体外肝癌细胞株进行检测,选取rbm8a表达水平最低的细胞株,调取rbm8a基因的编码序列(codingsequence,cds)序列,构建到慢病毒过表达载体上;采用包装过表达慢病毒及对照慢病毒,感染靶细胞;经westernblot验证rbm8a过表达效率;获得稳定rbm8a高表达的rbm8a-oe细胞株,并建立空载rbm8a-nc细胞株作为对照;(3)在以上构建的细胞系)中采用cck-8检测细胞的增殖能力变化;(4)facs(annexinⅤ-pe/7aad)检测上述四株细胞凋亡能力变化;(5)facs检测上述四株细胞周期变化;(6)划痕实验检测敲低及回补后rbm8a后细胞转移能力的变化;(7)transwell实验检测敲低及回补后rbm8a后细胞侵袭能力的变化;(8)细胞骨架染色检测检测敲低及回补后RBM8A后细胞骨架形态学的变化。结果:(1)Western blot筛选结果表明,Bel-7404细胞株的RBM8A表达水平最高,用于后续构建Bel7404-RBM8A-KD细胞株;而HL-7702细胞株RBM8A表达水平最低,用于后续构建HL7702-RBM8A-OE细胞株;(2)CCK8细胞增殖实验结果表明:Bel-7404细胞株在RBM8A被敲低后,细胞增值能力下降(P=0.00325);HL-7702细胞株在RBM8A过表达后,细胞增殖能力上升(P=0.00159);(3)流式细胞仪检测结果表明:Bel-7404细胞株中RBM8A被敲低后,细胞凋亡明显增加(P=0.0004);HL-7702细胞株中RBM8A过表达后,细胞凋亡明显下降(P=0.000358);(4)流式细胞仪检测结果表明:Bel-7404细胞株中RBM8A被敲低后,S期细胞量较NC组有所上升,G1期有所下降;(5)划痕实验、transwell侵袭实验结果显示:Bel-7404细胞株中RBM8A被敲低后,肝癌细胞迁移降低(P=0.04383)、侵袭能力下降(P=0.0089),而RBM8A回补后肝癌细胞侵袭再次明显增强(P=0.020727)、转移能力再次亦明显增强(P=0.0016);(6)细胞骨架染色观测结果显示Bel-7404细胞株中RBM8A被敲低后,肝癌细胞形态变化明显,呈现偏圆、少伪足形态;而RBM8A回补后肝癌细胞形态再次变为与空载组细胞形态相似。结论:下调RBM8A基因后肝细胞癌细胞的分化增殖能力、转移侵袭能力明显下降,而凋亡能力明显增强,并且细胞周期有停滞在S期的趋势。此研究表明RBM8A基因对于诱导肝细胞癌细胞凋亡及细胞周期具有重要作用,RBM8A基因具有作为治疗肝细胞癌的新的基因靶向位点的潜在可能性。