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【目的】
全球各类疾病的发生率呈上升趋势。虽然产生疾病的病因有很多，研究表明遗传因素在许多常见的疾病中起着重要作用。RNA结合蛋白elavl1从属于ELAV家族，在斑马鱼胚胎早期各个细胞中均有表达，elavl1a是斑马鱼elavl1中较为重要的亚型。ELAVL1从细胞核转运至细胞质的过程在稳定mRNA靶标基因中起重要作用。这种过程，也称为核质穿梭，被认为是由具有各种机制的介质(包括PKC)严格调节。作为蛋白激酶家族成员之一，PKC在细胞的增殖和分化以及红细胞生成期间起关键作用。自噬对大脑的发育和稳态起着重要的作用，参与了多种中枢神经系统疾病的发病过程，抑制自噬可以阻断凋亡从而保护神经系统。因此，我们假设elavl1a在斑马鱼早期可能激活自噬，影响神经系统的发育，促进细胞的凋亡。而pkc可能通过介导elavl1磷酸化影响核质穿梭过程继而对红细胞生成产生影响。
【方法】
1.显微注射吗啉环反义核苷酸观察表型，免疫荧光与免疫组化观察表达情况；
2.使用实时荧光定量PCR检测自噬相关基因表达；
3.通过CRISPR-Cas9技术构建elavl1a-/-突变体；
4.使用PKC抑制剂或显微注射吗啉环反义核苷酸/突变同种型，利用邻联茴香胺染色检测胚胎红细胞生成；
5.利用蛋白质印迹实验或免疫荧光实验检测ELAVL1磷酸化或去磷酸化及核质穿梭能力；
6.利用联苯胺染色实验研究抑制PKC或敲降ELAVL1时细胞分化能力。
【结果】
1.敲降elavl1a后斑马鱼胚胎表观呈现出发育迟缓、卷尾等缺陷表型，并且斑马鱼脑部细胞凋亡数量显著增加；
2.敲降elavl1a后自噬相关基因，mtor、map1lc3a、map1lc3b、atg3、atg5及atg12表达量改变；
3.通过生物信息软件设计相应gRNA引物以及对应引物，利用CRISPR-Cas9技术成功构建elavl1a-/-突变体，敲除位于elavl1a第二个外显子中5个核苷酸。通过软件预测其翻译提前终止；
4.斑马鱼胚胎中使用PKC抑制剂，胚胎出现红细胞减少的异常表型。并且使用elavl1aMO得到类似表型。免疫共沉淀检测显示潜在的磷酸化条带，提示观察到得修饰与磷酸化对应。使用PKC抑制剂处理胚胎后磷酸化消失，提示elavl1磷酸化由pkc介导；
5.在斑马鱼胚胎，当单独施用低剂量elavl1aMO或PKC抑制剂时，红细胞生成没有变化。然而，联合使用低剂量的elavl1aMO与PKC抑制剂，与单独给药相比胚胎红细胞生成异常明显；
6.在Hemin诱导的人白血病K562细胞中，敲降PKCα或PKCδ/阻断PKCα或PKCδ活性或敲降ELAVL1导致细胞分化减缓，并且其分化的程度与抑制剂浓度正相关。核质分离后，蛋白质印迹实验发现细胞质中ELAVL1水平增高。敲降PKCα或PKCδ/阻断PKCα或PKCδ活性组中ELAVL1从细胞核到细胞质的穿梭明显受阻。免疫荧光染色进一步证实PKC抑制剂显著阻断ELAVL1的核质穿梭；
7.在斑马鱼胚胎中，通过注射突变形式的elavl1aΔSer219与elavl1aΔSer316mRNA到1细胞期的胚胎中，斑马鱼均出现红细胞减少的表型。而Hemin诱导的K562细胞中联苯胺染色表明elavl1aΔSer219和elavl1aΔSer316显著减缓了细胞分化。
【结论】
第一部分：ELAVL1基因在多物种中具有高度保守性。斑马鱼早期胚胎发育过程中elavl1具有丰富的表达。敲降elavl1a斑马鱼胚胎表观呈现出发育迟缓、卷尾等缺陷表型以及促进细胞的凋亡过程，自噬的标志基因表达水平出现显著性下调，mtor3’非编码区含有多个AU富集，可能是elavl1a的潜在靶基因，自噬其他标志基因及相关基因表达水平出现显著性上调。通过CRISPR-Cas9技术成功构建elavl1a-/-斑马鱼突变体。由此认为elavl1a对斑马鱼胚胎神经系统发育产生影响的主要原因可能与自噬过程相关。
第二部分：PKC抑制剂或敲降elavl1a阻碍斑马鱼胚胎红细胞生成，磷酸化出现于胚胎发育期间，抑制PKC或敲降ELAVL1阻碍Hemin诱导的K562细胞分化，PKC可以刺激ELAVL1磷酸化出核，抑制PKC活性阻碍ELAVL1核质穿梭，红细胞生成与K562细胞分化需要elav11a的Ser219和Ser316位点磷酸化，elavl1a和pkc在斑马鱼胚胎红细胞生成中具有协同作用。进一步实验证明在斑马鱼胚胎红细胞生成发育过程中，pkc介导的elavl1磷酸化这一机制非常重要。
全球各类疾病的发生率呈上升趋势。虽然产生疾病的病因有很多，研究表明遗传因素在许多常见的疾病中起着重要作用。RNA结合蛋白elavl1从属于ELAV家族，在斑马鱼胚胎早期各个细胞中均有表达，elavl1a是斑马鱼elavl1中较为重要的亚型。ELAVL1从细胞核转运至细胞质的过程在稳定mRNA靶标基因中起重要作用。这种过程，也称为核质穿梭，被认为是由具有各种机制的介质(包括PKC)严格调节。作为蛋白激酶家族成员之一，PKC在细胞的增殖和分化以及红细胞生成期间起关键作用。自噬对大脑的发育和稳态起着重要的作用，参与了多种中枢神经系统疾病的发病过程，抑制自噬可以阻断凋亡从而保护神经系统。因此，我们假设elavl1a在斑马鱼早期可能激活自噬，影响神经系统的发育，促进细胞的凋亡。而pkc可能通过介导elavl1磷酸化影响核质穿梭过程继而对红细胞生成产生影响。
【方法】
1.显微注射吗啉环反义核苷酸观察表型，免疫荧光与免疫组化观察表达情况；
2.使用实时荧光定量PCR检测自噬相关基因表达；
3.通过CRISPR-Cas9技术构建elavl1a-/-突变体；
4.使用PKC抑制剂或显微注射吗啉环反义核苷酸/突变同种型，利用邻联茴香胺染色检测胚胎红细胞生成；
5.利用蛋白质印迹实验或免疫荧光实验检测ELAVL1磷酸化或去磷酸化及核质穿梭能力；
6.利用联苯胺染色实验研究抑制PKC或敲降ELAVL1时细胞分化能力。
【结果】
1.敲降elavl1a后斑马鱼胚胎表观呈现出发育迟缓、卷尾等缺陷表型，并且斑马鱼脑部细胞凋亡数量显著增加；
2.敲降elavl1a后自噬相关基因，mtor、map1lc3a、map1lc3b、atg3、atg5及atg12表达量改变；
3.通过生物信息软件设计相应gRNA引物以及对应引物，利用CRISPR-Cas9技术成功构建elavl1a-/-突变体，敲除位于elavl1a第二个外显子中5个核苷酸。通过软件预测其翻译提前终止；
4.斑马鱼胚胎中使用PKC抑制剂，胚胎出现红细胞减少的异常表型。并且使用elavl1aMO得到类似表型。免疫共沉淀检测显示潜在的磷酸化条带，提示观察到得修饰与磷酸化对应。使用PKC抑制剂处理胚胎后磷酸化消失，提示elavl1磷酸化由pkc介导；
5.在斑马鱼胚胎，当单独施用低剂量elavl1aMO或PKC抑制剂时，红细胞生成没有变化。然而，联合使用低剂量的elavl1aMO与PKC抑制剂，与单独给药相比胚胎红细胞生成异常明显；
6.在Hemin诱导的人白血病K562细胞中，敲降PKCα或PKCδ/阻断PKCα或PKCδ活性或敲降ELAVL1导致细胞分化减缓，并且其分化的程度与抑制剂浓度正相关。核质分离后，蛋白质印迹实验发现细胞质中ELAVL1水平增高。敲降PKCα或PKCδ/阻断PKCα或PKCδ活性组中ELAVL1从细胞核到细胞质的穿梭明显受阻。免疫荧光染色进一步证实PKC抑制剂显著阻断ELAVL1的核质穿梭；
7.在斑马鱼胚胎中，通过注射突变形式的elavl1aΔSer219与elavl1aΔSer316mRNA到1细胞期的胚胎中，斑马鱼均出现红细胞减少的表型。而Hemin诱导的K562细胞中联苯胺染色表明elavl1aΔSer219和elavl1aΔSer316显著减缓了细胞分化。
【结论】
第一部分：ELAVL1基因在多物种中具有高度保守性。斑马鱼早期胚胎发育过程中elavl1具有丰富的表达。敲降elavl1a斑马鱼胚胎表观呈现出发育迟缓、卷尾等缺陷表型以及促进细胞的凋亡过程，自噬的标志基因表达水平出现显著性下调，mtor3’非编码区含有多个AU富集，可能是elavl1a的潜在靶基因，自噬其他标志基因及相关基因表达水平出现显著性上调。通过CRISPR-Cas9技术成功构建elavl1a-/-斑马鱼突变体。由此认为elavl1a对斑马鱼胚胎神经系统发育产生影响的主要原因可能与自噬过程相关。
第二部分：PKC抑制剂或敲降elavl1a阻碍斑马鱼胚胎红细胞生成，磷酸化出现于胚胎发育期间，抑制PKC或敲降ELAVL1阻碍Hemin诱导的K562细胞分化，PKC可以刺激ELAVL1磷酸化出核，抑制PKC活性阻碍ELAVL1核质穿梭，红细胞生成与K562细胞分化需要elav11a的Ser219和Ser316位点磷酸化，elavl1a和pkc在斑马鱼胚胎红细胞生成中具有协同作用。进一步实验证明在斑马鱼胚胎红细胞生成发育过程中，pkc介导的elavl1磷酸化这一机制非常重要。