研究目的角膜碱烧伤作为眼科急诊中常见的疾病之一,常引起角膜混浊和角膜新生血管形成,严重时甚至可导致患者丧失视力。现有的角膜碱烧伤疗法存在有创、疗效有限及药物副作用可能引起严重的眼部并发症等不足。因此,探索针对角膜碱烧伤安全有效的新疗法成为近年来眼科研究的热点。前期研究提示,碱烧伤会引起活性氧自由基（Reactive Oxygen Species,ROS）增多,后者可通过激活炎症反应、促进角膜新生血管生长等对角膜造成严重损伤。此外,新生血管还易导致角膜发生脂质渗出和沉积。因此,我们推测角膜碱烧伤的损伤过程中存在脂质过氧化损伤引发的细胞死亡方式——铁死亡（Ferroptosis）,而靶向铁死亡的治疗可能是改善角膜碱烧伤的潜在疗法。铁死亡是一种新型的、脂质过氧化产物及铁离子依赖的,且不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡方式。无论是活性氧自由基还是游离铁离子增多,均可能引发脂质过氧化产物堆积,从而攻击细胞膜和线粒体,引发铁死亡。Ferrostatin-1（Fer-1）是铁死亡特异的小分子抑制剂,通过捕获细胞中毒性自由基而挽救铁死亡。多项研究提示Fer-1可有效改善多种铁死亡相关疾病的发生发展,表明其用于临床转化治疗相关疾病的潜力。然而,铁死亡在角膜碱烧伤中的作用及Fer-1的治疗效果尚不清楚。本研究通过碱烧伤造模,检测小鼠角膜中是否发生铁死亡,并研究Fer-1给药能否改善碱烧伤引起的角膜损伤。滴眼给药具有简单易行、副作用小等优势,是一种理想给药途径。但受限于泪液冲刷、眨眼反射及眼表屏障的存在,传统滴眼液的生物利用度往往很低。另外,由于Fer-1水溶性差且在体内有效作用时间较短,其在临床治疗中的应用具有一定的局限。脂质体含有类细胞膜的磷脂双分子层结构,可通过将药物包裹于脂质体囊泡中而增强药物的穿透性和溶解性。同时,脂质体具有无毒性、增强药物稳定性以及可生物降解等优点,是眼科临床上广泛应用的,极具潜力的药物递送系统之一。基于此背景,本研究进一步设计了一种Fer-1脂质体滴眼液,探索其能否有效改善碱烧伤角膜损伤及作用机制,并通过体内外实验评估Fer-1脂质体的安全性。研究方法本研究分三部分,第一部分旨在探索碱烧伤引起的角膜损伤中是否发生铁死亡及潜在机制。选择18只C57BL/6小鼠分3组,第1组为健康对照组,第2、3组小鼠用碱液烧伤右眼角膜并分别用生理盐水及200μM的Fer-1每日2次滴眼处理14天。在给药前和给药后的第3,7,14天,分别对小鼠进行裂隙拍照,评估其新生血管长度、面积及损伤评分。14天处理结束后处死小鼠,每组取部分小鼠眼球解剖、分离角膜并拍照,部分角膜在戊二醛中固定并通过透射电镜观察线粒体形态,余下角膜抽提m RNA并进行实时荧光定量聚合酶链式反应;另取部分眼球固定、切片行H＆E染色及免疫组化。第二部分旨在研究Fer-1脂质体对碱烧伤角膜的治疗效果及其作用机制。首先,通过薄膜旋蒸法制备Fer-1脂质体,并行动态光散射测定及透射电镜拍照。体内实验部分,取60只C57BL/6小鼠分为6组,除第1组外,其余5组均进行碱烧伤造模及滴眼给药。其中,第2组滴加生理盐水,第3、4、5、6组分别滴加200μM的Fer-1溶液、200μM的Fer-1脂质体溶液、200μM的地塞米松溶液和200μM的地塞米松脂质体溶液,动物处理及实验同第一部分。体外实验部分,通过划痕迁移实验检测Fer-1及Fer-1脂质体对血管内皮生长因子（VEGF）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）迁移能力的抑制作用。第三部分旨在验证Fer-1脂质体的安全性。体外实验部分,对不同浓度Fer-1脂质体处理的人角膜上皮细胞（HCECs）进行CCK-8试验及活死细胞染色以检测细胞活性。体内实验部分,对第二部分研究中的第1-4组小鼠在给药过程中每隔3天监测体重。处死小鼠后取血行血常规、肝肾功能指标检验,并取心肝脾肺肾固定、切片行H＆E染色。另取12只C57BL/6小鼠分为4组,均不进行碱烧伤,但分组给药同第二部分研究中的第1-4组,在第14天对小鼠行裂隙拍照及眼表荧光素钠染色。研究结果与健康对照相比,碱烧伤后的小鼠眼表出现明显的角膜混浊、新生血管生长,且组织学结果提示其出现明显的角膜水肿、炎性细胞浸润及新生血管生成。Fer-1给药可以显著改善这些损伤,提示碱烧伤引起的角膜损伤中存在铁死亡。后续实验表明,碱烧伤激活了角膜组织ROS相关基因Gclm,Gpx1,Gsr,Prdx1,Sod1和铁死亡标志基因Ptgs2的表达,并引起脂质过氧化指标4-HNE显著增加,而Fer-1能有效改善上述指标,证实碱烧伤诱导了角膜组织铁死亡的发生。进一步的机制研究显示,铁死亡正性调控因子Acsl4表达增强,而铁死亡负性调控因子Gpx4被抑制,同时伴有线粒体形态破坏、嵴减少。这些结果提示碱烧伤导致铁死亡促进通路被激活而阻碍通路被抑制,同时大量ROS攻击线粒体,二者同时促进了角膜组织铁死亡的发生。Fer-1处理恢复了上述基因的表达并缓解了角膜损伤,提示铁死亡可作为治疗角膜碱烧伤的靶点。基于此,本研究利用脂质体负载Fer-1以提高其生物利用度及疗效。结果显示,除了铁死亡相关指标,碱烧伤诱导的角膜损伤、炎症反应及新生血管形成均得到有效改善。包括炎症指标IL-1β和IL-6,新生血管相关调控因子Vegfa,Vegfc,Vegfr3,Mmp2,α-Sma及CD31的异常表达均被Fer-1及Fer-1脂质体所挽救,且Fer-1脂质体的治疗效果更为显著。体外的划痕迁移实验进一步表明,Fer-1及Fer-1脂质体均能抑制VEGF诱导的HUVEC细胞迁移的能力,且Fer-1脂质体的抑制作用更明显。以上数据表明,Fer-1脂质体对于角膜碱烧伤损伤的治疗作用显著优于Fer-1游离药。另外,本研究评估了Fer-1脂质体用于角膜碱烧伤治疗的安全性,体内外的实验结果均表明Fer-1脂质体无明显毒副作用。研究结论本研究首次证明角膜碱烧伤过程中存在铁死亡这一新型细胞死亡方式,铁死亡特异性抑制剂Fer-1能有效改善碱烧伤导致的角膜损伤,并缓解碱烧伤引起的炎症反应和新生血管形成。此外,Fer-1脂质体相比于Fer-1游离药具有更显著的治疗效果,且安全性良好,有望成为应用于临床靶向铁死亡、改善碱烧伤角膜的潜在新型治疗方式。