隐孢子虫(Cryptosporidium)是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的，它是一种属于顶端复合物门的寄生性原虫。隐孢子虫有很多种类，其有效虫种有10余种，对人和大多数脊椎动物造成感染的主要是Tyzzer于1912年发现的另一种虫种--微小隐孢子虫(C.parvum)。隐孢子虫感染引起的隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种全球性的人畜共患寄生虫病。正常人感染隐孢子虫后，虽可引起急性腹泻，但常为自限性：免疫力低下、功能缺陷或免疫抑制的患者(如婴幼儿、艾滋病患者、营养不良者、器官移植后、肿瘤患者等)感染此虫后，则可引起严重胃肠炎并伴有水样腹泻，导致大量体液丢失而危及生命，该病已被确定为引起人腹泻的六大病因之一。在艾滋病(AIDS)患者中感染率高达48％左右，长期的严重腹泻，是艾滋病病人的重要致死因素之一。该虫致病力较强，小剂量(50％感染剂量ID50为132个卵囊)的微小隐孢子虫卵囊足以引起健康自愿受试者感染。由于隐孢子虫卵囊体积微小(直径4-6μm)、分布广泛，常规氯化饮水消毒方法不能将其杀灭，故对人类公共卫生造成很大威胁。国外暴发流行时有报告，多发生于病人或病牛接触后的人群，或幼儿园和托儿所等集体单位。发生在美国威斯康星州(Wisconsin)密尔沃基(Milvaukee)的那次暴发中，据估计超过40余万居民染上了水样腹泻，致死100多人，危害非常大。因此，隐孢子虫病成为目前各国重点研究的寄生虫病之一。我国自1987年南京报道首例隐孢子虫病以来，江苏、浙江、安徽、福建、内蒙古、云南、四川、山东及上海等省市均已证实有该病存在，其感染率为1.4％-13.3％不等。自从发现隐孢子虫以来，许多研究者一直致力于该病的防治研究，但迄今为止，对该病尚无有效的防治措施，因此对该病的早期诊断、治疗以及研究防治该病的疫苗就显得尤为重要。 卡介苗是用来预防结核病的牛型结核分枝杆菌减毒活疫苗，以卡介苗为载体的基因重组卡介苗因其具有集疫苗与佐剂于一体的特点，在免疫功能的研究、传染病和肿瘤的防治中均发挥了重要作用，成为近年来研究的热点。 本研究利用分子生物学技术，将编码表面抗原CP23和CP15/60的基因构建在同一穿梭质粒表达载体上，转化BCG，高效表达CP15/60-23融合蛋白，对重组蛋白进行纯化和鉴定；并用重组BCG直接免疫小鼠，观察到它能刺激机体产生特异性抗体和细胞因子，具有较强的免疫原性，为重组BCG-CP15/60-23疫苗的应用奠定了基础。 本研究的主要方法、结果及结论: 1.微小隐孢子虫动物模型的建立及其卵囊的分离纯化 方法：在饮水中加入地塞米松磷酸钠注射液(15μg/ml)抑制BALB/c小鼠免疫功能，灌胃接种微小隐孢子虫卵囊(1×105个/只)使小鼠感染，收集小鼠粪便，用改良抗酸染色法确定感染成功，用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊。用PBS稀释纯化的卵囊，加入DMSO，置于-40℃3h后，放入液氮中保存。 结果：成功建立了微小隐孢子虫感染的BALB/c小鼠动物模型，所有实验小鼠均感染，从接种3天起向体外排出卵囊；改良抗酸染色法蓝绿色背景下玫瑰红色的卵囊清晰可见；不连续蔗糖密度梯度离心法获得了大量纯度较高且有活力的卵囊，适合于免疫学和分子生物学使用。 结论：微小隐孢子虫感染动物模型的成功建立及高纯度卵囊的获得，为隐孢子虫的传代及后续的分子生物学和免疫学的研究打下了基础。 2.微小隐孢子虫表面抗原CP23基因、CP15/60-23复合基因载体的构建及鉴定 方法：将纯化的微小隐孢子虫卵囊(约1×108个)加入裂解液后在液氮中反复冻融3次，用酚-氯仿抽提法提取微小隐孢子虫卵囊的基因组DNA。根据GenBank报道的CP23基因和CP15/60基因序列的开放读码框架分别设计合成引物；PCR法扩增CP23、CP15/60基因片段，切胶纯化回收后，分别将二者克隆至TA克隆载体pMD18-TSimpleVector；通过酶切、测序鉴定正确后，将CP23基因片段亚克隆至pET-30a(+)载体，构建成pET-30a-23质粒：再将CP15/60基因片段克隆至pET-30a-23质粒，构建成pET-30a-15/60-23质粒，然后将二者分别转化大肠埃希菌DH5α。 结果：提取微小隐孢子虫基因组DNA，PCR扩增出预期的CP23片段(342bp)和CP15/60片段(444bp)；成功构建了pMD18-T-23和pMD18-T-15/60质粒，以及重组表达质粒pET-30a-23和pET-30a-15/60-23。测序结果表明：与GenBank报道的基因序列相比，CP23基因有8个碱基不同，导致3个编码氨基酸发生改变，并且比原序列多出了6个碱基；CP15/60基因有6个碱基不同，导致1个编码氨基酸发生改变，但都没有改变原序列的开放阅读框架。 结论：成功构建了pET-30a-23和pET-30a-15/60-23重组表达质粒。 3.微小隐孢子虫重组BCG-CP15/60-23疫苗的构建及鉴定 方法：以pET-30a-15/60-23质粒为模板，PCR扩增CP15/60-23基因片段，并克隆至TA克隆载体pMD18-TSimpleVector。通过酶切、测序鉴定正确后，将CP15/60-23基因片段亚克隆至PMV-262穿梭质粒载体，构建成PMV-262-CP15/60-23重组质粒，用电穿孔法将其转化至BCG中。热诱导使其表达，表达蛋白用SDS-PAGE初步分析；经过纯化、复性后的重组抗原用Westernblot分析鉴定。 结果：PCR扩增出预期的CP15/60-23片段(786bp)，成功构建了pMD18-T-CP15/60-23以及重组表达质粒PMV-262-CP15/60-23。经热诱导后表达出了约46kDa的融合蛋白，纯化后的重组蛋白经Westernblot分析鉴定证实能被兔抗隐孢子虫多克隆抗体识别。 结论：成功构建了重组表达质粒PMV-262-CP15/60-23，并成功将其转化至BCG中，为重组BCG-CP15/60-23疫苗的研究打下了基础。 4.微小隐孢子虫重组BCG-CP15/60-23疫苗免疫保护性的研究 方法：100只BALB/c小鼠，按每组25只随机分为4组，每只小鼠尾静脉注射BCG-WT、BCG-PMV-262、BCG-PMV-262-CP-15/60-23(各0.1ml，含1×106个细菌)，对照组为PBS，共免疫3次，每次间隔2周，于每次免疫后2周重组BCG组尾静脉取血分离血清(共3次)，用ELISA法检测免疫血清中IgG抗体的动态变化；于第三次免疫2周后无菌取小鼠脾脏，研磨后，取1×106个脾细胞，分别加入超声粉碎的BCG-WT、BCG-PMV-262、BCG-PMV-262-CP-15/60-23(各10μg)，37℃5％CO2孵箱中培养72h，收集培养上清液用ELISA法检测细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-12等。 结果：1.BCG-PMV-262-CP-1523免疫后能刺激小白鼠产生IgG抗体，且随着免疫次数的增加抗体滴度逐渐增高。2.各组小鼠脾细胞经体外抗原刺激后，细胞因子IFN-γ与对照组相有显著性差异(P＜0.05)。 结论：重组BCG-CP15/60-23疫苗能刺激机体产生高滴度的IgG抗体，使脾细胞增生，体外能刺激免疫后的脾细胞产生保护性细胞因子IFN-γ。 总之，本研究完成了建立卵囊传代的小鼠动物模型、纯化卵囊的不连续蔗糖密度梯度离心法以及基因组的提取等内容；构建了原核表达载体pET-30a-23和pET-30a-15/60-23以及穿梭质粒表达载体PMV-262-CP15/60-23，并成功地转化到BCG中。通过诱导表达、纯化、鉴定了CP15/60-23重组蛋白。用重组BCG-CP15/60-23疫苗免疫小鼠证实了它有一定的免疫保护性。本研究为重组BCG-CP15/60-23疫苗的应用奠定了基础。