研究目的:　　 心肌缺血性损伤(Myocardial Ischemia,MI)是严重危害我国中老年人健康的重大疾病,也是最常见的猝死因为之一。研究防治心肌缺血损伤的药物具有重要的理论意义和社会意义。　　 我们前期的研究结果表明,从葛花中提取分离的异黄酮化合物葛花苷具有明显的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性,亦具有明显的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用,但是该化合物水溶性较差,使其研究受到一定限制。因此,我们对葛花苷结构进行修饰,在保留活性基团的基础上,增加水溶性基团,克服该化合物所存在的不足,得到一个新化合物-甲胺鸢尾素(methylamine irisolidone,MMI)。该化合物水溶性增加,易吸收。小鼠急性毒性实验和体外细胞毒实验表明,该新型化合物毒性较低。我们拟在此基础上深入研究这一新化合物对缺血心肌的保护作用,从其对缺血心肌细胞凋亡的影响深入研究其作用机制,为缺血性心脏病的治疗提供新的药物靶点和创新型药物。　　 研究方法:　　 1.(1)分别采用过氧化氢(H2O2)、氯化钴(CoCl2)和连二亚硫酸钠(Na2S2O4)制备不同的心肌细胞缺氧损伤模型,以MTT法检测损伤心肌细胞细胞存活率,以确定诱导心肌细胞损伤模型合适的药物浓度及作用时间。(2)采用荧光染料Hoechst33342染色观察缺氧损伤心肌细胞凋亡形态,进一步明确H2O2、CoCl2、Na2S2O4三种药物诱导心肌细胞凋亡模型的最佳浓度。　　 2.(1)甲胺鸢尾素预处理心肌细胞12h后,采用H2O2诱导细胞氧化应激损伤,以瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态,研究甲胺鸢尾素对氧化应激损伤心肌细胞形态的保护作用；以MTT法检测细胞存活率,确定甲胺鸢尾素对氧化应激损伤心肌细胞的保护作用。(2)以JC-1荧光染色,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化；同时在荧光显微镜下观察荧光分布,研究甲胺鸢尾素对氧化应激损伤心肌细胞线粒体膜电位的影响。　　 3.(1)甲胺鸢尾素预处理心肌细胞12h后,采用Na2S2O4建立心肌细胞化学性缺氧损伤模型,以MTT法检测细胞存活率,确定甲胺鸢尾素对缺氧心肌细胞的保护作用。(2)采用Hoechst33342染色观察心肌细胞凋亡形态,研究甲胺鸢尾素对缺氧心肌细胞凋亡的保护作用。(3)采用Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,进一步确定甲胺鸢尾素抑制心肌细胞凋亡的作用。(4)采用超微量ATPase测定试剂盒测定心肌细胞总ATPase活性,确定甲胺鸢尾素对缺氧心肌细胞ATPase活性的改善作用。(5)以JC-1荧光染色,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化,确定甲胺鸢尾素对缺氧心肌细胞线粒体膜电位的保护作用以及与心肌细胞凋亡、ATPase之间的相关性。(6)以PI染色,流式细胞仪检测细胞周期,研究甲胺鸢尾素对心肌细胞周期的影响。　　 结果：　　 1.H2O2、CoCl2、Na2S2O4不同浓度作用相应时间均可显著降低心肌细胞存活率,且随浓度及作用时间增加心肌细胞存活率明显降低,表明三者可对心肌细胞造成明显损伤。Hoechst33342染色荧光显微镜下观察心肌细胞凋亡状态,结果显示,正常对照组细胞核完整,染色均匀,而模型组出现浓染强荧光细胞核,呈亮蓝色的半月形、马蹄形和小圆点,边界清晰、细胞核断裂等典型的细胞凋亡特征。　　 2.H2O2损伤模型组细胞存活率明显低于正常组(P<0.01)；MMI0.1μmol/L预处理组与模型组相比细胞存活率无明显差别(P>0.05)；从0.5μmol/L组开始,与模型组比较,随着MMI浓度升高细胞存活率明显升高(P<0.05,P<0.01),表明MMI预处理能增强心肌细胞抗氧化损伤能力,提高心肌细胞存活率。瑞氏-吉姆萨染色结果显示,与模型组比较,10μmol/L MMI能改善心肌细胞损伤。JC-1荧光染色结果显示,模型组心肌细胞经H2O2损伤后,与正常组比较,线粒体膜电位明显降低,红绿荧光比值减小(P<0.01)。1、5、10μmol/L MMI处理组与模型组相比,其红绿荧光强度比值明显升高(P<0.05),表明心肌细胞MMP下降减轻。　　 3.Na2S2O4损伤模型组细胞存活率明显低于正常组(58.4±3.5％,P<0.01)；MMI(10、5、1μmol/L)组细胞存活率明显高于模型组(88.8±3.2％,80.7±2.9％,67.1±4.3％vs58.4±3.5％,P<0.01),且随着MMI浓度增加而升高。AnnexinV-FITC/PI双染结果显示,正常对照组心肌细胞凋亡较少,模型组心肌细胞凋亡率显升高(P<0.01)；与模型组相比,MMI(10、5、1μmol/L)预处理能明显降低Na2S2O4诱导的心肌细胞凋亡率(P<0.01),MMI10μmol/L组对细胞凋亡抑制作用最强；同时Hoechst33342染色荧光显微镜下观察心肌细胞凋亡形态,结果显示,正常对照组细胞核完整,而模型组出现细胞核断裂、浓染等典型的细胞凋亡特征；与模型组相比,MMI(10、5、1μmol/L)预处理能明显改善细胞凋亡状态,减少凋亡细胞数目。JC-1荧光染色结果显示,与正常组比较,模型组心肌细胞MMP明显降低,红绿荧光比值减小(0.32±0.04 vs0.74±0.087,p<0.01)；1、5、10μmol/L MMI预处理组与模型组相比,其荧光强度比值明显升高(0.45±0.051,0.41±0.031,0.38±0.035 vs0.32±0.04,p<0.05)。超微量ATPase测定试剂盒测定细胞总ATPase活力,结果显示,与正常组比较,模型组总ATPase活力明显降低(p<0.01)。MMI(1、5、10μmol/L)预处理组与模型组相比,其ATPase活力明显升高,且随MMI浓度升高而增大(p<0.01,p<0.05)。流式细胞仪检测心肌细胞周期的变化,结果显示,无论是正常组、模型组还是MMI预处理组,均对大鼠心肌细胞周期无显著影响。　　 结论：　　 1.H2O2、CoCl2、Na2S2O4不同浓度作用相应时间均可显著降低心肌细胞存活率,造成心肌细胞不同机制的缺氧损伤。　　 2.H2O2150μmol/L作用2h、CoCl2500μmol/L和Na282O42mmol/L作用12h可造成模拟体内心肌缺血损伤引发的心肌细胞凋亡的细胞损伤模型。　　 3.甲胺鸢尾素可以改善H2O2所致心肌细胞氧化应激损伤,其机制与稳定细胞膜、抑制线粒体膜电位下降,进而抑制心肌细胞凋亡有关。　　 4.MMI对正常心肌细胞周期没有显著影响。　　 5.MMI增加缺氧损伤心肌细胞存活率,减少心肌细胞凋亡,其机制可能与MMI抑制心肌细胞线粒体膜电位下降和增加细胞总ATPase活性有关。