脓毒症（Sepsis）是全世界住院患者最常见的死亡病因之一,据调查,全球每年脓毒症相关患者超过1900万,其死亡率超过40%,而在存活患者中约有300万存在如感染性心肌病的器官功能障碍和（或）认知功能的障碍。随着对脓毒症研究的不断深入,脓毒症现被定义为宿主对感染的免疫反应失调所导致的器官功能障碍并危及生命的疾病,其中宿主的免疫反应是不受控制的,并最终导致多器官衰竭。脓毒症的免疫发病机制是非常复杂的病理过程,涉及过度活化和抑制免疫反应,免疫抑制后期对宿主有害并且使它们易于获得继发性感染,研究发现脓毒症患者死亡常与其体内的免疫抑制密切相关,其中63%的脓毒症患者死于最初的5天之后。同时,临床研究发现,临床患者感染前的免疫状态直接决定感染患者的预后,并且进一步研究发现,免疫调节剂可以通过激活多种信号通路调节体内细胞因子的释放,并改善脓毒症患者体内免疫紊乱状态,从而有效维持了患者的正常免疫功能,减轻对器官的损害,最终降低脓毒症死亡率。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）是人体重要的固有免疫模式受体,细菌病原体感染后巨噬细胞可触发TLR启动防御机制。Toll样受体家族在识别微生物病原体中发挥重要作用。Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）信号通路在脓毒症防治中,尤其是对调控机体免疫系统并干预脓毒症具有重要作用,其有效减少抗生素等药物的应用,减小康复后的药物副损伤,可能为脓毒症的治疗提供新的策略。近年来,纳米医学的发展为脓毒症的防治提供了新疗法、新策略。因此,本研究通过干预TLR4信号通路途径,进而研究基于TLR4缓释纳米药物对脓毒症小鼠保护及其干预的机制,从而为临床治疗脓毒症提供新的治疗思路。第一部分 MPLA@PLGA纳米颗粒的制备及表征目的:TLR4信号通路的活化对于脓毒症防治具有重要作用。TLR4激动剂单磷酰脂质A（Monophosphate lipid A,MPLA）由于其水溶性差,无法直接使用,因此利用聚乳酸-聚羟基乙酸（Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）纳米颗粒装载MPLA制备出具有TLR4活性的纳米颗粒并表征其理化性质。方法:通过水包油（O/W）乳液法,我们利用PLGA纳米颗粒装载疏水性TLR4激动剂MPLA,制备了一种纳米药物,即MPLA@PLGA纳米颗粒,并对制备的纳米颗粒进行了表征分析,通过透射电子显微镜观察形状、纳米粒度及zeta电位仪检测纳米颗粒水合粒径、内毒素检测试剂盒检测MPLA在纳米颗粒中的装载率及释放情况、在不同溶液中MPLA@PLGA纳米颗粒的稳定性及荧光染料DID高氯酸盐（DID Perchlorate,DID）装载的PLGA纳米颗粒行小动物活体荧光成像模拟观察PLGA纳米颗粒在体内的滞留情况,为后续的实验分析提供保障。结果:表征分析证明,该纳米颗粒在透射电子显微镜下具有均匀的球形结构,水合粒径检测数据显示,MPLA@PLGA纳米颗粒的平均粒径约为110 nm。用内毒素检测试剂盒检测表明,MPLA在PLGA纳米粒中的装载率为49.43%,且MPLA@PLGA中的MPLA具有较好的缓释作用。此外,MPLA@PLGA纳米颗粒在去离子水、磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffer saline,PBS）和 Dulbecco’s modified eagle 细胞培养液（Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM）中粒径稳定,说明该纳米颗粒在各种溶液中都具有良好的稳定性。用荧光染料DID装载的PLGA纳米颗粒（DID@PLGA）通过小动物活体荧光成像来模拟MPLA@PLGA的体内滞留行为,结果提示,聚乳酸纳米颗粒装载的MPLA在体内具有较长的滞留。结论:成功制备了 MPLA@PLGA纳米颗粒,制备的MPLA@PLGA纳米颗粒具有良好的生物相容性、稳定性及缓释作用,能够用于后续研究分析。第二部分纳米颗粒（MPLA@PLGA）引发脓毒症小鼠中相关细胞因子变化及增强天然免疫系统的机制研究目的:探讨纳米颗粒（MPLA@PLGA）在体内单菌感染以及多菌感染模型中相关细胞因子变化以及天然免疫细胞的变化,体外巨噬细胞吞噬能力的变化,对增强天然免疫系统的机制进行研究,为脓毒症的免疫调控提供新思路。方法:首先明确纳米颗粒（MPLA@PLGA）体内的最佳作用时间。在单菌感染模型中,首先将小鼠随机分成PBS处理组,MPLA@PLGA6h处理组,MPLA@PLGA 24h处理组,MPLA@PLGA48h处理组,在相对应处理后,向小鼠腹腔注射大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）,并记录小鼠生存率及体重变化。随后研究了 MPLA@PLGA纳米颗粒加速脓毒症小鼠体内细菌的清除,将PBS组及MPLA@PLGA组皮内注射24小时后向小鼠腹腔注射E.coli感染6小时后,取小鼠主要脏器进行Luria-Bertani培养基（LB Culture,LB）平板涂板并进行对比分析,取感染16小时的小鼠主要脏器进行苏木精伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色切片对比分析;之后探究MPLA@PLGA影响免疫系统的作用机制,分析PBS组及MPLA@PLGA组分别皮内注射后24小时、皮内注射后24小时后在注射E.coli感染6小时后血液中包括白细胞介素（Intertleukin,IL）、干扰素（Interferon,INF）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）、单核细胞趋化蛋白（Monocyte chemoattractant protein,MCP）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）等各种细胞因子、自然杀伤（Natural killer,NK）细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞、F4/80+CD80+细胞、F4/80+CD206+细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的变化以及腹腔灌洗液中NK细胞的变化。之后明确纳米颗粒（MPLA@PLGA）在盲肠结扎和穿刺（Cecum ligation and puncture,CLP）诱导的多菌感染模型中的保护作用,随机分为假手术组、注射PBS组及注射MPLA@PLGA组,对比3组小鼠的生存率及体重变化。最后我们在体外模拟和研究MPLA@PLGA纳米颗粒对巨噬细胞的作用,我们选择了巨噬细胞系Raw 264.7细胞,分别给予PBS及MPLA@PLGA处理,后与荧光染料Cy5.5标记的E.coli共孵育,通过流式细胞术和共聚焦荧光观察巨噬细胞的极化情况及细菌的吞噬情况。结果:研究结果表明,MPLA@PLGA纳米颗粒处理24小时具有最佳的体内保护作用,小鼠生存率可达80%。小鼠主要脏器HE染色结果及LB涂板显示,MPLA@PLGA处理的小鼠的主要脏器炎症、损伤程度及菌落数均低于PBS处理的小鼠。皮内注射MPLA@PLGA纳米颗粒或PBS 24小时后,皮内注射MPLA@PLGA纳米颗粒的小鼠NK细胞、单核细胞和F4/80+CD80+细胞百分率明显升高,而CD8+T细胞、B细胞、CD4+T细胞、F4/80+CD206+细胞和中性粒细胞百分率变化不大,各种细胞因子变化不大。在单菌感染模型中,经MPLA@PLGA预处理的脓毒症小鼠中NK细胞、中性粒细胞和F4/80+CD80+细胞百分率不仅明显升高,还显著增强多种细胞因子的分泌,包括TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17A和MCP-1水平显著上升,IL-10有所下降,而IL-1β、GM-CSF、IL-27和IFN-β分泌水平在两组之间没有明显变化。在多菌感染模型中,经MPLA@PLGA纳米颗粒预处理的脓毒症小鼠的生存率较PBS预处理组小鼠生存率高,可达60%。体外实验则证实我们制备的MPLA@PLGA纳米颗粒促进Raw 264.7细胞向F4/80+CD80+分化并提高其细菌摄取能力,增强Raw 264.7细胞的杀菌能力。结论:制备的MPLA@PLGA纳米颗粒能够安全的激活TLR4信号通路,预先激活健康小鼠天然免疫系统,未出现“细胞因子风暴”,受细菌感染后能迅速上调细胞因子及天然免疫细胞水平,产生了更多的NK细胞、中性粒细胞及F4/80+CD80+细胞并促进NK细胞向感染部位富集,有效增强脓毒症小鼠的体内免疫应答,保护了小鼠体内主要脏器,减少细菌对脏器组织的破坏,增加了小鼠的生存率。体外实验表明纳米颗粒提高了巨噬细胞的细菌吞噬能力,更有效的杀死细菌。因此,MPLA@PLGA纳米颗粒在单菌感染及多菌感染小鼠模型中有效实现了对脓毒症的免疫保护作用。第三部分纳米颗粒（MPLA@PLGA）对E.coli.感染的长效及特异性保护目的:研究纳米颗粒（MPLA@PLGA）对E.coli感染的长效保护及特异性保护,为临床脓毒症预防提供新的思路和方法。方法:MPLA@PLGA预处理的小鼠存活30天后,对其体内天然免疫细胞及细胞因子水平与正常健康小鼠进行分析,明确MPLA@PLGA纳米颗粒对脓毒症免疫抑制期小鼠免疫系统的影响。之后对存活的小鼠和健康的小鼠分别给予大剂量E.coli二次感染,观察小鼠生存率及体重变化,并取感染6小时后的小鼠主要脏器行LB平板涂板,评估经MPLA@PLGA处理后存活小鼠抵御二次E.coli感染的能力。对MPLA@PLGA处理后的存活小鼠和健康小鼠分别给予金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.a.u）致死性感染的攻击,评估经MPLA@PLGA处理后存活小鼠对E.coli感染保护作用的特异性。结果:研究发现,与健康小鼠相比,经MPLA@PLGA处理后存活小鼠的CD4+T细胞、NK细胞、单核细胞、B细胞和CD4+记忆性T细胞的百分率明显下降,但中性粒细胞、CD8+T细胞和CD8+记忆性T细胞的百分比显著增加,各种功能性细胞因子,特别是IL-1β,IL-27,IL-17A,INF-β和IL-10有较为明显的增加,所有第一次E.coli感染中经MPLA@PLGA预处理后存活的小鼠在第二次大剂量E.coli感染后仍能100%存活,MPLA@PLGA预处理存活小鼠主要器官中的细菌计数明显更少,且存活小鼠的体重可在第二次E.coli诱导的脓毒症后5天左右恢复到感染前的水平。经S.a.u的致死性感染,MPLA@PLGA预处理存活小鼠与正常健康小鼠生存率为20%,未见差异。结论:脓毒症免疫抑制期出现免疫麻痹,制备的MPLA@PLGA纳米颗粒能改变脓毒症免疫抑制期小鼠的免疫稳态,具有长效保护作用,增加了记忆性免疫细胞的数量,促进免疫记忆产生,增强对细菌感染的二次保护能力,但抵抗细菌感染的能力存在特异性。