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国内外学者一直致力于通过组织工程的方法来进行再生医学的研究,而种子细胞是组织工程的必要条件之一。鉴于其具有多向分化能力,干细胞被认为是良好的种子细胞来源。在牙周再生领域,再生医学的发展也为组织修复再生提供了新的策略,而牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是牙周组织中天然存在的干细胞,也是目前牙周组织工程最有潜力的种子细胞之一,具有成骨、成牙骨质等多种分化潜能,但天然的PDLSCs存在较少,且分离培养和筛选过程复杂,很难大量的培养以作为组织再生的种子细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是从早期胚胎中分离得到的干细胞,在不同的培养条件下,具有分化为多种类型的细胞的潜力,但是由于受到伦理问题的限制,目前仅能用于动物实验,因此科学家们开始尝试其他方式来获得分化能力更强的细胞。细胞重编程是将已分化成熟的体细胞逆转为未分化状态的过程,而被重编程后的细胞具有多能性,具备分化为机体内多种细胞类型的潜能。诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是近几年来干细胞领域的研究热点之一。2006年,京都大学的Yamanaka研究团队革命性得将小鼠成纤维细胞成功诱导为iPSCs。诱导成功的iPSCs不仅在细胞形态和分化潜能方面都类似于ESCs,而且避免了围绕ESCs使用的伦理学问题。基因重编程诱导多能干细胞使得为了临床治疗目的,采用转录因子将细胞从一种细胞系逆转到另一种细胞系成为可能。这一前沿研究成果也为解决骨再生问题,乃至于重建牙周组织提供了全新的思路：如果可以通过诱导重编程技术直接将体外培养的牙周膜成纤维细胞去分化为多能干细胞,作为“种子细胞”用于牙周组织工程,将有助于突破困扰该领域进展的瓶颈。在临床中,通过阻生牙和正畸牙的拔除,我们可以获得牙周膜,从而利用其培养出牙周膜细胞,进而将其诱导成为iPSCs,作为牙周组织工程的种子细胞来使用。另外,细胞膜片技术是在组织再生中具有广阔应用前景的一项技术。它不仅可以很好地保存细胞外基质,还能减少细胞移植后无效移植细胞的数量和支架材料的使用,有利于组织的再生。将重编程得到的多能干细胞在体外制备成细胞膜片用于牙周组织工程中,也可以成为牙周组织再生的新方式。[实验目的]本研究的目的即原代培养人牙周膜细胞,将外源性基因(Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc)通过病毒介导的转染系统来对人牙周膜细胞进行重编程,然后对构建成功的hPDLC-iPSCs进行生物学鉴定。鉴定证实细胞构建成功后进行体外实验评价hPDLC-iPSCs的成骨分化能力,最后利用hPDLC-iPSCs形成的细胞膜片植入裸鼠头盖骨缺损,评价其体修复骨缺损的能力,为今后在牙周组织工程中的应用奠定基础。[材料与方法]本课题的研究内容分为以下四个部分：第一部分人牙周膜来源诱导多能干细胞的建立1.1人牙周膜细胞(hPDLCs)的原代培养及鉴定取健康患者正畸牙,组织块法培养牙周膜细胞,运用细胞免疫荧光对细胞表面标志物(波形蛋白、角蛋白、纤连蛋白和Ⅰ型胶原酶)进行鉴定。1.2 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备从孕13.5天CF-1胚胎组织中分离提取纤维细胞并扩增辐照处理细胞1小时,冻存备用。1.3慢病毒的包装及感染hPDLCs将携带Oct-4、Sox-2、c-Myc和klf-4基因的载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞,48小时后收集上清液并进行慢病毒滴度测定。用包装携带外源性目的基因的病毒液感染牙周膜细胞。1.4病毒感染后的细胞培养以及挑取iPSCs克隆将感染后的细胞铺于MEF细胞上,更换为hESCs培养基,3-4周后挑取克隆,选择碱性磷酸酶阳性细胞进行后续实验。第二部分人牙周膜来源诱导多能干细胞的鉴定确认通过诱导确实获得了牙周膜来源的诱导多能干细胞(hPDLC-iPSCs):2.1细胞的形态观察观察诱导获得的细胞,与诱导前的PDLCs以及hESCs的形态进行对比。2.2 iPSCs碱性磷酸酶(Alkaline phosphatasee,AP)染色检测诱导获得的细胞的碱性磷酸酶活性,并与hESCs进行对比。2.3 iPSCs免疫荧光染色免疫荧光染色检测诱导获得的细胞是否表达hESCs特异性蛋白,包括胞膜蛋白(SSEA3、SSEA4),胞质蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和胞核蛋白(Oct-4、 Nanog)。2.4体内分化畸胎瘤实验对诱导获得的细胞进行扩增,注射到裸鼠背部和大腿内侧,观察是否有畸胎瘤形成。并对形成的畸胎瘤进行苏木精-伊红染色,镜下观察形成组织的情况,判断细胞是否具有向三个胚层组织分化的潜能。2.5拟胚体实验将细胞在体外悬浮培养,观察是否形成腔体形态,腔体形成七天后,进行贴壁培养,观察是否有细胞爬出。第三部分人牙周膜来源诱导多能干细胞体外成骨能力的评价3.1 hPDLC-iPSCs、hESCs以及PDLCs的成骨诱导分别培养hPDLC-iPSCs、hESCs以及PDLCs三种细胞,形成拟胚体后贴壁培养,常规培养后更换矿化诱导培养基(β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松)。3.2矿化结节形成茜素红染色观察细胞诱导矿化14天后的矿化结节形成情况,并定量分析。3.3ALP水平检测运用PNPP法定量检测细胞在诱导矿化7和14天的ALP活性。3.4 real-time PCR检测基因表达水平real-time PCR检测细胞在成骨诱导培养基中培养7天和14天后的成骨相关基因(ALP、OCN、Col-I和Runx2)表达。第四部分人牙周膜来源诱导多能干细胞膜片在骨缺损修复中的应用4.1 hPDLC-iPSCs、hESCs以及hPDLCs细胞膜片的制备三种细胞均在加入维生素C的成骨诱导培养基中培养21天,培养后期可见培养皿底部形成透明白色膜,即成功得到细胞膜片,小心刮下后得到细胞膜片,待用。4.2裸鼠头盖骨缺损模型的建立以及细胞膜片的修复实验设立三个小组,hPDLC-iPSCs膜片组、hESCs膜片组以及hPDLC膜片组；水合氯醛麻醉裸鼠,切开头部皮肤,暴露头盖骨,利用3.5mm环钻创造骨缺损,小心去除骨片后,在创口植入刮除的细胞膜片,拉拢头部皮肤,缝合,注射抗生素。4.3细胞膜片评价分别在手术4周和8周后,处死裸鼠后取材,多聚甲醛固定后,进行micro-CT重建分析,之后HE染色和Masson染色观察分析。[结果]1.原代培养一周后,可见细胞从组织块中爬出。免疫荧光显示细胞的波形蛋白、纤连蛋白和Ⅰ型胶原酶的表达为阳性,角蛋白为阴性,证明该培养的细胞为PDLCs。2.第一周后可见PDLCs形态发生变化,由梭形成纤维细胞状变为聚集的圆形克隆状,在3周后左右挑取克隆后发现有AP染色呈阳性,且具有典型的hESCS克隆形态。重编程成功的细胞表达ESCS特异性蛋白,包括胞膜蛋白(SSEA3、 SSEA4),胞质蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和胞核蛋白(Oct-4、Nanog),能形成畸胎瘤,具有向三个胚层分化的潜力,且能在体外形成拟胚体。3.成骨诱导14天后,茜素红染色显示hPDLC-iPS组的矿化结节数多于其他两组,而ALP的检测结果也与染色保持一致。另外,成骨相关因子ALP、OCN、Col-I和Runx2在hPDLC-iPSCs中的表达也更高,表明hPDLC-iPSCs的成骨能力强于hES和PDLCs。4.动物实验了三个小组,hPDLC-iPSCs、hESCS和PDLC膜片均培养成功,micro-CT重建分析发现hPDLC-iPSCs膜片对骨缺损的修复作用明显强于另外两种细胞膜片,而HE染色和Masson染色也说明hPDLC-iPSCs膜片的新骨形成更多。[结论]1.通过慢病毒转染hPDLCs,诱导获得的细胞碱性磷酸酶阳性,能够表达hESCs特异性的表面标记,并且具有形成畸胎瘤向三胚层分化等能力,说明hPDLC-iPSCs构建成功。2.本研究结果提示,诱导得到的hPDLC-iPSCs在体外具有良好的成骨作用,与hESCs相比,hPDLC-iPSCs能更快地诱导成骨矿,且相关成骨因子表达明显比hESCs以及未诱导的PDLCs更强。3.基于组织工程方法诱导细胞分泌细胞外基质后形成的细胞膜片,是一种较简单、有效的骨缺损修复手段,在体内实验中,相比hESCs和hPDLCs膜片,hPDLC-iPSCs膜片能更好的修复头盖骨缺损,在骨组织工程中具有良好的应用前景。4.综合以上结论,hPDLC-iPSCs为牙周再生的组织工程修复提供了新的选择,具有潜在的临床应用价值。