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生物催化技术符合“绿色化学”所倡导的资源有效利用和节能减排理念,是绿色化学与绿色化工发展的重要趋势之一。非水相生物催化则为许多水不溶性底物的生物催化反应提供了广阔的前景,为绿色化学的发展开辟了新的研究领域。近年来,非水相生物催化的一个主要研究方向是反应介质绿色化。深共熔溶剂(Deep eutectic solvents,DESs)因其制备简便、性质可设计、可生物降解等优点,被评为环境友好型生物催化介质的极佳候选者。DESs可以作为反应溶剂或共溶剂、酶的预处理溶剂等用于生物催化,尤其是非水相生物催化中,引起了学术界的关注。现有研究表明DESs形成的氢键网络结构可以稳定酶分子的构象,提高酶在DESs水溶液中的催化活性和稳定性。目前关于DESs作为反应介质应用于生物催化的研究大部分集中于DESs-水混合溶剂体系,但水的加入不仅直接改变了DESs性质,也改变了催化反应,尤其是酶促合成反应的热力学平衡。传统研究结果认为纯DESs对酶的活性及结构影响较大,关于微水DESs作为生物催化非水介质的研究还是空白领域。此外,关于DESs对酶分子结构和活性影响的机理研究比较欠缺,DES成分及性质对酶催化活性的影响尚未有系统研究,无法合理科学地设计DESs以适应不同酶促反应的需求。为解决以上问题,本研究展开对DESs应用于非水相生物催化的应用基础研究。首先,本研究分析了DESs氢键供体、氢键受体及官能团对DESs基本理化性质的影响,探讨DESs组分与性质间的构效关系,同时分析微量水对DESs化学性质的影响,为理性设计DESs提供理论依据;其次,研究DESs对细胞结构的影响,评估DESs在重组大肠杆菌胞内酶破壁提取中应用的可行性,建立绿色且高效的胞内酶提取新方法;第三,以几个重要的生物催化用酶作为模型酶,全面考察了微水DESs对酶的储存稳定性、热稳定性及催化反应活性的影响,并依据DESs性质与酶生物活性的影响关系,理性设计出适宜作为脂肪酶催化反应介质的DESs;第四,研究了微水DESs中全细胞催化反应的效率,将酸性亲水DESs细胞毒性作用大的缺点转变为优点,拓宽了这类DESs作为非水相反应介质的应用范围。通过这几方面研究,为DESs在非水相生物催化领域的潜在应用提供理论基础。(1)分析了不同系列DESs组分对其基本理化性质的影响。以氯化胆碱为亲水DESs的氢键受体,薄荷醇/癸酸为疏水DESs氢键受体,探索酸类、醇类、酰胺类、萜烯类氢键供体对DESs物理性质(密度、黏度)和化学性质(ENR值、π*值、氢键酸度α值、氢键碱度β值)的影响;以甘油为亲水DESs的氢键供体,癸酸为疏水DESs氢键供体,探索氯化胆碱结构类似物、季铵盐、萜烯类氢键受体对DESs理化性质的影响。以红外光谱手段考察DESs组分间氢键网络结构的强弱,辅助解释DESs组分对理化性质影响的机制。结果发现,HBAs和HBDs结构中官能团的种类和数量的增加有利于增强体系间氢键网络结构的强度,从而增加DESs的密度和黏度。除物理性质外,官能团的增加还有利于增加DESs的极性和氢键酸度。而组分碳链长度的增加对氢键相互作用和化学性质均起负调控作用。同时,以计算得到的DESs分子总能量、偶极矩、极化率、最低空轨道能(LUMO能)、最高占有轨道能(HOMO能)及LUMO与HOMO能差值作为输入层,建立5-13层隐含层的神经网络系统,可高效精准地预测室温下DESs的密度、ENR值、π*值、α值和β值。(2)评估了DESs的吸湿性及微量水对DESs性质的影响。结果表明DESs经分子筛脱水后,体系内仍有2%(w/w)左右的微量水。DESs具有强吸湿性,主要来自于组分自身的吸湿性,而DESs组分间氢键网络结构的形成有利于降低体系的吸湿性。即便是极微量的水也会显著增加DESs的极性和氢键酸度,改变DESs的水分活度,因此将DESs作为催化反应介质应用于非水相生物催化应用中,需严格控制DESs及所处环境的含水量。(3)为大规模高效获取酶制剂,基于疏水DESs对细胞膜的渗透作用建立了提取重组大肠杆菌胞内酶的方法。经过电镜观察到疏水DESs可以部分溶解细胞内膜磷脂,增加细胞膜的通透性,从而高效地释放细胞内的内容物。通过筛选和优化后,薄荷醇-油酸以1:1摩尔比制备的疏水DESs,添加到缓冲液中制成0.5%(v/v)悬浮液,处理浓度OD600值为5的菌体,在室温下200 rpm振荡提取3 h,提取得到的胞内酶比活为2.02 U/mg,以超声破碎法效率为对照,DESs释放法对胞内酶的释放率为对照组的114.58%,比活高1.96倍。(4)以β-葡萄糖苷酶和南极假丝酵母脂肪酶为模型酶,研究了微水DESs对糖苷酶和脂肪酶酶学性质的影响。以酶在25℃下孵育的半衰期t1/2(min)表征DESs中酶的储存稳定性,以热力学失活速率常数k(min-1)和表观活化能(Ea,k J/mol)表征不同温度下DESs对酶活性的影响,即DESs中酶的热稳定性,分析DESs性质对酶的储存稳定性及热稳定性的影响。通过圆二色谱解析DESs对酶二级结构的影响,进一步阐释DESs对酶分子结构的影响。结果表明,DESs组分与酶分子氨基酸极性侧链发生氢键相互作用,包裹在酶分子表面,使其结构更加紧密,因此DESs作为生物催化溶剂有利于提高酶的热稳定性。DESs与酶分子间相互作用,使DESs部分组分取代与酶天然结合的水分子,导致酶分子结构部分改变。疏水DESs中两种酶的储存稳定性比缓冲液差,亲水DESs中脂肪酶的相容性有所提升。亲水DESs组分中羧基会使酶完全不可逆失活,但羟基对酶的储存稳定性有保护作用。此外,DESs中酶的储存稳定性基本与DESs的极性和α值成反比,与β值成正比。(5)以脂肪酶催化苯甲醇和乙酸乙烯酯转酯化合成乙酸苄酯的反应为模式反应,考察了微水DESs中脂肪酶的催化合成活性。结果发现疏水DESs更适宜用作CALB催化转酯化反应的介质,疏水DESs中羧基和萜烯类化合物有利于提高酶的催化活性。依据DESs性质与酶生物活性的影响关系,可以理性设计出适宜作为脂肪酶催化反应介质的DESs。DESs中脂肪酶促反应效率可以通过水含量、p H印迹、制备酶粉时添加冻干保护剂或无机盐等调控手段进行调节。将多种调控手段一起处理DESs与酶粉,调控手段间的协同效应有利于缩短反应达到产率最大值的时间,进一步提高产率最大值。(6)含季铵盐、羧酸等物质制备的亲水DESs中酶制剂迅速发生不可逆失活,为拓宽这类DESs在非水相生物催化中的应用范围,探索了重组大肠杆菌脂肪酶静息细胞作为催化剂在DESs中的催化效率,结果表明全细胞催化剂在季铵盐、羧酸类DESs具有良好的反应活性,最适宜的全细胞催化介质是非离子型疏水DESs。