论文部分内容阅读
心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是全球发病和死亡的主要原因之一,约占全球死亡人数的三分之一。心肌梗死（myocardial infarction,MI）是其中最严重的一种的类型,导致广泛的心肌细胞（cardiomyocytes,CMs）死亡。MI对CMs造成不可逆损伤,传统的治疗方案可以在一定程度上提高患者生存率,而无法修复受损CMs,因此在恢复心功能方面十分有限。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）作为新兴疗法可以弥补这方面的不足,在梗死区域可以向CMs分化,维持组织稳态和参与组织再生。因此如何高效促进BMSCs向CMs分化是目前研究的热点内容之一。胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）都是在体内广泛分布的,重要的心肌保护性生长因子。两者均是BMSCs重要的旁分泌因子,体内外可调节多种生物学功能,可抑制在氧化应激环境下细胞的凋亡,促进细胞分化、迁移、新生血管的形成等,提高移植细胞的存活率,是有潜力的候选因子。分化机制的探讨有助于心肌内源性修复和再生的策略的制定,IGF-1和b FGF均是PI3K/Akt信号通路的有效激活剂,因此本文初步探讨PI3K/Akt是否参与IGF-1和b FGF促进BMSCs向CMs分化的过程。为制定刺激心肌内源性修复和再生的策略提供细胞水平依据,本文采用IGF-1和b FGF单独或联合诱导BMSCs向CMs分化,观察BMSCs分化效率和心肌特异性基因的表达规律,并进一步对两种生长因子诱导机制进行初步探讨。1.相较于单独诱导组IGF-1和b FGF联合作用于BMSCs使心肌特异性标志物表达更加显著采用全骨髓贴壁法提取纯化BMSCs,并进行纯度鉴定。随后将第三代BMSCs分为空白对照组、IGF-1组、b FGF组和IGF-1联合b FGF组。各组诱导72 h后去除诱导剂,使BMSCs定向分化4周后,采用免疫细胞化学检测Desmin、Cx43和c Tn I表达;免疫荧光检测TPM和c Tn T表达;Western blot检测Desmin、Cx43和c Tn I表达;透射电镜观察IGF-1和b FGF联合诱导组的超微结构;各组诱导72 h后去除诱导剂,使BMSCs定向分化1周、2周和4周后采用RT-q PCR检测GATA4和Mef-2c的表达。结果显示（1）免疫细胞化学、免疫荧光和Western blot结果显示相较于空白对照组,心肌特异性蛋白Desmin、Cx43、c Tn I、TPM和c Tn T在各个诱导组均出现表达,最高表达量均出现在IGF-1和b FGF的联合诱导组,提示IGF-1和b FGF的联合处理是促进BMSCs向CMs分化更为高效的方法。（2）透射电镜观察到平行排列的肌丝,胞质内线粒体、内质网等丰富的细胞器,与CMs特征一致。（3）GATA4和Mef-2c是心肌发育的早期标志物,RT-q PCR结果得出IGF-1联合b FGF组出现GATA4和Mef-2c的表达,提示BMSCs进入心肌分化的早期阶段,逐渐向成熟CMs发育。2.IGF-1和b FGF通过PI3K/Akt途径促进BMSCs向CMs分化分别向IGF-1和b FGF诱导液中加入PI3K抑制剂LY294002,即IGF-1的促分化机制验证部分分为空白对照组、IGF-1组和IGF-1+LY294002组;b FGF的促分化机制验证部分分为空白对照组、b FGF组和b FGF+LY294002组。采用Western blot检测Desmin、Cx43、c Tn I表达,RT-q PCR检测Tbx5和Bin1表达,观察LY294002对上述心肌特异性标志物表达的影响。结果表明与IGF-1组和b FGF组单独诱导组相比,IGF-1和b FGF组分别加入LY294002后显著降低了相应心肌标志物的表达,为进一步验证PI3K/Akt通路是否参与分化过程,采用Western blot检测通路下游信号分子Akt和p Akt表达,结果显示与空白对照组相比,加入IGF-1和b FGF诱导剂后Akt磷酸化水平明显升高,同时单独诱导剂组中LY294002的加入显著抑制了通路蛋白Akt的磷酸化水平,提示IGF-1和b FGF促进BMSCs向CMs的分化过程可能与PI3K/Akt途径有关。结论:IGF-1和b FGF单独或者联合处理BMSCs,均可有效促进BMSCs向CMs的分化,并且IGF-1和b FGF的联合诱导是更加高效的方法;PI3K/Akt途径参与了IGF-1和b FGF定向诱导BMSCs向CMs分化过程。