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猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,无囊膜,基因组为单股负链环状DNA,是目前发现的最小的动物病毒。分为PCV1和PCV2两个基因型,PCVl无致病性,是猪源细胞系PK-15的污染物,在健康猪体内可检测到PCV1的抗体；PCV2有致病性,是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)及繁殖障碍等的重要病原。PCV2基因组含有两个主要的开放阅读框,其中ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白Cap蛋白,蛋白的分子量大小约为30kD,是病毒的主要结构蛋白,也是PCV2的主要免疫原。尽管两个基因型ORF2基因的同源性达68%左右,但它们刺激机体产生的抗体没有交叉反应,因此ORF2蛋白在诊断及疫苗研究中具有重要意义,是PCV2的研究热点。1.依据从临床断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)死亡猪病料中分离且已进行基因组测序的PCV2(SD-11株)毒株和本实验室保存的PCV2XSC毒株(GenBank登录号为DQ104422)的基因序列,分别设计合成一对引物,用于扩增ORF2全基因,并分别将其克隆到pMD18-T simple载体上,获得重组质粒pMD18-T-ORF2,酶切鉴定并测序。将这两株PCV2ORF2序列与GenBank中公布的国内外10个不同毒株的PCV2ORF2核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较并绘制进化树。结果表明,SD-11毒株的ORF2基因与比较的10个毒株的同源性均较低,其中核苷酸同源性在90.2%～93.2%之间,氨基酸同源性在87.6%～94%之间,与美国毒株(GenBank登录号为DQ397521.1)的同源性最高,可达94%,进化树分析发现,该毒株的ORF2基因形成了一个独立的分支,表明该毒株与所比较的10个毒株的亲缘关系较远；XSC毒株与中国分离株09GDLB (GenBank登录号为HQ395027.1)及韩国分离株C7155(GenBank登录号为FJ905463.1) ORF2的核苷酸及氨基酸同源性较高,均在98.7%以上,进化树分析表明XSC毒株与韩国C7155分离株形成了一个小分支,以上结果说明SD-11毒株及XSC毒株在我国的流行或与种猪的引进有关。将PCV2SD-11毒株及XSC毒株的全基因组、ORF1及ORF2基因分别与不同基因型的PCV参考毒株(PCV1、PCV2a、PCV2b、PCV1/2a、PCV2c)进行比较,结果表明PCV2SD-11毒株与PCV2a (GenBank登录号AJ223185)的同源性最高,推测SD-11毒株为PCV2a基因型;XSC毒株的全基因组、ORF1及ORF2基因与PCV2b (GenBank登录号AY909004)毒株的同源性最高,推测XSC毒株为PCV2b基因型。2.根据PCV2a分离株及GenBank公布的PCV2b XSC毒株基因序列,分别设计合成一对引物,对PCV2a和PCV2b毒株的ORF2基因进行PCR扩增。将ORF2基因分别克隆到杆状病毒转移载体PFastBacTM1中,获得重组转移载体pFast-ORF2a及pFast-ORF2b,分别转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体reBacmid-ORF2a及reBacmid-ORF2b,用脂质体法将重组穿梭载体质粒转染sf9细胞,获得的重组病毒分别命名为reBacmid-ORF2a-Cap及reBacmid-ORF2b-Cap。感染重组杆状病毒的细胞经RT-PCR检测到了PCV2a和PCV2bORF2基因的mRNA;间接免疫荧光检测结果表明,表达的重组蛋白能够被猪抗PCV2高免血清识别；SDS-PAGE与Western blotting分析均可见大小约为30kD的特异性条带,表明reBacmid-Cap在sf9细胞中成功表达了PCV2a和PCV2b的ORF2蛋白；用终点稀释法、间接免疫荧光法及噬斑法测定病毒滴度,并比较各个方法的优缺点,以期找到一种测定重组杆状病毒滴度的较好方法。结果表明,终点稀释法和间接免疫荧光法多次重复结果较为理想,而噬斑法容易出现假阳性及假阴性,且试验结果重复时差异较大。