菲律宾蛤仔组织细胞的培养

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本文以我国重要海水养殖经济贝类菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum Adams etReeve)为材料,对其外套膜、鳃组织及血细胞进行了组织和细胞培养的研究,以期为建立贝类细胞系打下基础。 主要研究结果如下: 1、不同消毒剂对培养组织的处理结果表明:当术必泰消毒剂中醋酸氯己定(C<,26>H<,36>O<,4>N<,10>Cl<,2>)的有效浓度为100-200 μg/ml、或复方新洁尔灭中苯扎溴铵(C<,21>H<,38>BrN)的有效浓度为300-600 μg/ml时,处理30 s,能有效杀灭粘附在外套膜组织块上的细菌,并使细胞正常贴壁生长;1‰的术必泰(醋酸氯己定有效浓度5μg/ml)与双抗溶液(青霉素4000 U/ml,链霉素5000 U/ml)按体积比1:1混合使用,对外套膜(处理10min)和鳃组织(处理15min)均有很好地杀菌效果,既能保持细胞活性又不影响细胞生长,而且重复性较好。 2、在D-MEM、M199和RPMI-1640三种基础培养基中均添加了10%小牛血清、0.5%水解乳蛋白等相同成分后,比较上述三种培养基的效果表明:蛤仔的外套膜和鳃组织在三种培养基中均能正常生长。对外套膜组织而言,D-MEM的效果明显优于M199和1640培养基,培养的细胞最长可成活14 d;对鳃组织而言,D-MEM和M199的效果优于1640。 3、在温度26℃、pH 7.4左右的条件下进行封闭培养,组织块培养法的培养效果优于细胞培养法;从总体来看,外套膜组织的生长状况好于鳃组织。实验所用贴壁物质中,多聚赖氨酸的贴壁效果优于鼠尾胶原及明胶,使用多聚赖氨酸8 h后的组织块贴壁率可达90%以上。 4、菲律宾蛤仔的外套膜细胞在D-MEM和M199两种培养基中,随着培养时间的不同,细胞的RNAfDNA比值呈现规律性的变化。RNA/DNA平均比值的变化,在D-MEM培养基中,前期较为平缓:而在M199培养基中,前期呈陡然上升趋势,二者在108 h后均呈下降趋势。 5、以碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的酶活力为指标,比较了外套膜组织在不同培养基、不同培养时间下的酶活力变化。结果表明,在所用D-MEM和M199两种培养基中,随着培养时间的不同,碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的比活力值均呈现规律性的变化。外套膜组织在两种培养基中均为培养60 h时、酸性磷酸酶的比活力值达到最大,但整个培养过程中酸性磷酸酶的酶活力值均低于新鲜组织的酶活力值。外套膜组织在两种培养基中均为培养84 h时、碱性磷酸酶的比活力值达到最大,且高于新鲜组织的酶活力值。 6、外套膜细胞生长5 d后,经消化进行传代培养,静置15 h后传代细胞开始贴壁;但随着培养时间的延长,细胞形态变得不规则,细胞间界限逐渐模糊,细胞内颗粒增多;培养至7-8 d后大多数细胞皱缩死亡而脱落。 7、血细胞在pH 7.6的D-MEM培养基中可正常生长,培养1-2 h后即可伸出伪足,8-10 h后大多数细胞贴壁;在培养基中添加100-150 mg/L的PHA,可促进血细胞的增殖。培养6 d后传代培养,静置8-10 h后多数细胞可贴壁;但此后细胞数量未见明显增加,随培养时间的延长,细胞逐渐脱落,培养基中出现大量碎片样物质;培养至7 d时,经台盼兰染色法检测,活细胞数已降至50%。 8、在透射电镜下观察比较了新鲜细胞与培养后细胞超微结构的异同。结果显示,培养2 d后的外套膜和鳃组织的致密程度不如新鲜组织,而且外套膜和鳃细胞中的线粒体数量均比新鲜组织中的有所减少;培养6 d后的组织更加疏松、细胞间隙增大,线粒体嵴的数量少,高尔基体等细胞器的形态变得不规则,表明随着培养时间的延长,细胞出现老化现象。
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