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目的：应用不同浓度酒精处理人肝L02细胞，观察酒精对细胞的损伤作用及氧化应激改变，探讨p62/Nrf2信号途径参与此过程时相关的作用机制。
方法：应用MTT法检测L02细胞增殖率及各种因素对细胞生存的影响；应用RNA干扰法下调细胞内p62的表达，RT-PCR法检测p62siRNA对L02细胞内p62mRNA表达量的影响，蛋白免疫印迹法(Western-Blot)检测L02细胞内p62蛋白表达量；利用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒分离细胞质和细胞核蛋白，Western-Blot法检测Nrf2在细胞质和细胞核中的表达量；DCFH-DA染色荧光显微镜观察与流式细胞术检测L02细胞内活性氧水平；比色法检测L02细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性；羟胺法检测L02细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性。
结果：1.不同浓度酒精对肝L02细胞生存率的影响。
L02细胞在酒精浓度分别为50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L的无血清培养基中培养24h，与0mmol/L酒精组相比，细胞生存率分别为80.42%(P＜0.05)、65.09%(P＜0.01)、48.25%(P＜0.01)、41.87%(P＜0.01)、37.54%(P＜0.01)，表明细胞生存率随酒精浓度升高而减少。
2.P62siRNA对L02细胞生存率的影响。
200mmol/L+p62siRNA组细胞生存率显著低于200mmol/L酒精处理组(P＜0.05)，而0mmol/L+p62siRNA组细胞生存率与0mmol/L组相比无显著差别。
3.酒精及p62siRNA对L02细胞内活性氧水平的影响。
DCFH-DA染色法荧光显微镜结果显示：与0mmol/L组相比，200mmol/L酒精组细胞内活性氧水平明显升高。200mmol/L+p62siRNA组细胞内活性氧水平明显高于200mmol/L酒精处理组。流式细胞术结果显示：与0mmol/L组相比，200mmol/L酒精组细胞内活性氧水平显著升高(P＜0.01)。200mmol/L+p62siRNA组细胞内活性氧水平显著高于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)。两种方法均显示0mmol/L+p62siRNA组细胞内活性氧水平与0mmol/L组相比无显著差别。
4.酒精及p62siRNA对L02细胞内Nrf2表达量及分布的影响。
与0mmol/L酒精组相比，200mmol/L酒精组细胞胞质内Nrf2水平显著降低(P＜0.01)，胞核内Nrf2水平显著升高(P＜0.01)。200mmol/L+p62siRNA组细胞胞质内Nrf2水平显著高于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)，胞核内Nrf2水平显著低于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)。而0mmol/L+p62siRNA组细胞胞质与胞核内Nrf2水平与0mmol/L组相比均无显著差别。
5.酒精及p62siRNA对L02细胞内SOD和GSH-PX活性的影响。
与0mmol/L酒精组相比，200mmol/L酒精组细胞内SOD和GSH-PX活性显著增强(P＜0.01)。200mmol/L+p62siRNA组细胞内SOD和GSH-PX活性均显著低于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)。而0mmol/L+p62siRNA组细胞内SOD和GSH-PX活性与0mmol/L组相比均无显著差别。
结论：
酒精能显著降低人肝L02细胞生存率，使细胞内活性氧水平显著提高，对细胞产生氧化应激损伤，诱导细胞抗氧化应激转录因子Nrf2的表达和细胞核转位。该作用受p62蛋白的调控，与p62/Nrf2信号途径有关，并通过p62/Nrf2信号途径对细胞产生保护作用。
方法：应用MTT法检测L02细胞增殖率及各种因素对细胞生存的影响；应用RNA干扰法下调细胞内p62的表达，RT-PCR法检测p62siRNA对L02细胞内p62mRNA表达量的影响，蛋白免疫印迹法(Western-Blot)检测L02细胞内p62蛋白表达量；利用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒分离细胞质和细胞核蛋白，Western-Blot法检测Nrf2在细胞质和细胞核中的表达量；DCFH-DA染色荧光显微镜观察与流式细胞术检测L02细胞内活性氧水平；比色法检测L02细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性；羟胺法检测L02细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性。
结果：1.不同浓度酒精对肝L02细胞生存率的影响。
L02细胞在酒精浓度分别为50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L的无血清培养基中培养24h，与0mmol/L酒精组相比，细胞生存率分别为80.42%(P＜0.05)、65.09%(P＜0.01)、48.25%(P＜0.01)、41.87%(P＜0.01)、37.54%(P＜0.01)，表明细胞生存率随酒精浓度升高而减少。
2.P62siRNA对L02细胞生存率的影响。
200mmol/L+p62siRNA组细胞生存率显著低于200mmol/L酒精处理组(P＜0.05)，而0mmol/L+p62siRNA组细胞生存率与0mmol/L组相比无显著差别。
3.酒精及p62siRNA对L02细胞内活性氧水平的影响。
DCFH-DA染色法荧光显微镜结果显示：与0mmol/L组相比，200mmol/L酒精组细胞内活性氧水平明显升高。200mmol/L+p62siRNA组细胞内活性氧水平明显高于200mmol/L酒精处理组。流式细胞术结果显示：与0mmol/L组相比，200mmol/L酒精组细胞内活性氧水平显著升高(P＜0.01)。200mmol/L+p62siRNA组细胞内活性氧水平显著高于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)。两种方法均显示0mmol/L+p62siRNA组细胞内活性氧水平与0mmol/L组相比无显著差别。
4.酒精及p62siRNA对L02细胞内Nrf2表达量及分布的影响。
与0mmol/L酒精组相比，200mmol/L酒精组细胞胞质内Nrf2水平显著降低(P＜0.01)，胞核内Nrf2水平显著升高(P＜0.01)。200mmol/L+p62siRNA组细胞胞质内Nrf2水平显著高于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)，胞核内Nrf2水平显著低于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)。而0mmol/L+p62siRNA组细胞胞质与胞核内Nrf2水平与0mmol/L组相比均无显著差别。
5.酒精及p62siRNA对L02细胞内SOD和GSH-PX活性的影响。
与0mmol/L酒精组相比，200mmol/L酒精组细胞内SOD和GSH-PX活性显著增强(P＜0.01)。200mmol/L+p62siRNA组细胞内SOD和GSH-PX活性均显著低于200mmol/L酒精处理组(P＜0.01)。而0mmol/L+p62siRNA组细胞内SOD和GSH-PX活性与0mmol/L组相比均无显著差别。
结论：
酒精能显著降低人肝L02细胞生存率，使细胞内活性氧水平显著提高，对细胞产生氧化应激损伤，诱导细胞抗氧化应激转录因子Nrf2的表达和细胞核转位。该作用受p62蛋白的调控，与p62/Nrf2信号途径有关，并通过p62/Nrf2信号途径对细胞产生保护作用。