论文部分内容阅读
【目的】:研究内源性甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)是否通过BMP2信号通路和/或通过TGF-β信号通路调节骨折愈合,并进一步探讨其调节机制。【方法】:体内实验选用8周龄PTH野生型(WT, PTH+/+)和PTH基因敲除(KO, PTH-/-)雄性小鼠作为实验对象,作右侧股骨开放性骨折模型,并于骨折后7天、14天和21天处死,运用X线、小动物显微CT、组织学、免疫组织化学比较分析两组小鼠的术后骨折愈合情况及骨痂特征,并且将骨痂组织提取的蛋白通过Western blot的方法分析骨形成相关蛋白表达水平。体外实验选用8周龄WT和KO雄性小鼠取骨髓间充质干细胞,并诱导成成骨细胞及软骨细胞,运用组织学及免疫组织化学比较分析KO、WT两组细胞形态及功能差异,并将细胞提取的RNA和蛋白质通过RT-PCR和Western blot的方法分析成骨细胞和软骨细胞相关蛋白的表达水平。【结果】:内源性PTH缺乏引起骨折愈合障碍,Mi-CT结果显示其骨痂区骨密度降低,骨痂区非骨性组织比例增高,软骨性骨痂向骨性骨痂转换延迟,骨性骨痂形成减少(I型胶原沉积减少,Runx2蛋白表达下调)。PTH基因敲除小鼠骨痂区Runx2、BMPR2、pSMAD1/5/8免疫组化染色强度明显降低,而Sox9、TGF-βR2、pSMAD2/3的染色强度无明显差异。同时我们的实验发现PTH基因敲除导致骨痂区CREB的表达明显降低。提取骨痂蛋白,做Western blot检测,其结果与免疫组化结果一致。取间充质干细胞做微球培养,加成软骨诱导液,诱导12天后,切片做免疫组化显示,PTH基因敲除型小鼠与野生型小鼠间充质干细胞软骨分化功能无明显差异。取PTH基因敲除小鼠骨髓间充质干细胞,并予以BMP2刺激,发现其pSamdl/5/8水平下降;而予以TGF-β刺激后,其pSmad2/3水平无明显差异。间充质干细胞加成骨诱导液,诱导4天后,Western blot检测检测结果结果显示BMPR2表达降低。诱导7天后,其成骨细胞ALP活性降低,给予dbcAMP可纠正,加PKA抑制剂(H89)能消除dbcAMP的作用;ALP染色结果显示内源性PTH缺失造成间充质干细胞成骨细胞分化能力下降。测细胞内cAMP浓度,结果显示内源性PTH缺乏导致小鼠间充质干细胞内cAMP浓度降低。【结论】:内源性PTH能提高细胞内cAMP浓度,通过cAMP/PKA/CREB途径提高BMPR2表达,从而增强BMP2/pSmad1/5/8信号通路的转导,发挥加速骨折愈合的作用。