【摘 要】
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目的:本实验以人骨髓间充质干细胞为细胞模型,将不同浓度的atRA与BMSCs共同孵育不同的时间,通过严格的体外实验,观察atRA作用后BMSCs细胞的活力及细胞表面CD54、CD106表达的变化
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目的:本实验以人骨髓间充质干细胞为细胞模型,将不同浓度的atRA与BMSCs共同孵育不同的时间,通过严格的体外实验,观察atRA作用后BMSCs细胞的活力及细胞表面CD54、CD106表达的变化。以探讨其在体外水平上atRA对CD54、CD106表达的影响,为该药在进一步实验及临床研究中提供实验依据。
方法:调整BMSCs细胞浓度为5×103/ml,接种于96孔板,每种浓度设3个平行孔。细胞培养液为含10%FCS的DMEM-LG培养基。加入不同浓度的atRA(空白对照组为O,A组为0.01μmol/L,B组为0.1μmol/L,C组为1.0μmol/L,D组10.0μmol/L),在37℃,5%CO2饱和湿度下CO2孵箱内共同孵育。采用四唑盐(MTT)比色法检测BMSCs细胞存活率。在不同时间(12h,24h,48h,96h),每孔加MTT(5g/L)10μl孵育4h,吸弃上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)50μl,振荡10min,充分溶解结晶,用酶标仪于450nm处测定吸光度(A)值。以上实验重复3遍,以检测BMSCs细胞存活率;另外调整BMSCs细胞浓度为5×104/ml,接种于6孔板,每种浓度设2个复孔,每孔总体系为2.5ml。加入不同浓度的atRA(空白对照组为O,A组为0.01μmol/L,B组为0.1μmol/L,C组为1.0μmol/L,D组10.0μmol/L),在37℃,5%CO2饱和湿度下CO2孵箱内共同孵育。在不同时间(12h,24h,48h,96h)把消化的细胞离心后将细胞浓度调整至5×106/ml,同时加入CD54-PE及CD106-FITC单抗各10μl,然后用流式细胞仪检测细胞表面的平均荧光强度。
结果:1)在本实验所用的培养条件下,用MTT法观察不同浓度atRA处理12h,24h,48h,96h对BMSCs细胞增殖的影响。结果表明atRA浓度为0.01μmol/L时对BMSCs增殖抑制与空白对照组比较无显著差异(P>0.05);atRA浓度为0.1μmol/L-10.0μmol/L时对BMSCs增殖抑制与空白对照组比较有显著差异(P<0.05);且在相同作用时间下,atRA对BMSCs细胞的增殖抑制作用随atRA浓度的升高而升高;当在相同的atRA作用浓度下,BMSCs细胞的增殖抑制作用随atRA作用时间的延长而升高,atRA浓度为0.1μmol/L-10.0μmol/L作用时间12h、24h、48h、96h组间比较有显著差异(P<0.05)。
2)流式细胞仪检测细胞表面CD54、CD106平均荧光强度。atRA浓度为0.01μmol/L-10.0μmol/L时对细胞表面CD54、CD106的作用与空白对照组比较有显著差异(P<0.05);且在相同作用时间下,atRA对BMSCs细胞CD54、CD106的作用随atRA浓度的升高而升高;当在相同的atRA作用浓度下,atRA对BMSC细胞CD54、CD106的作用随atRA作用时间的延长而升高;atRA浓度为0.01μmol/L-10.0μmol/L时12h、24h、48h、96h组间比较有显著差异(P<0.05)。
结论:1)atRA对BMSCs细胞有增殖抑制作用,浓度梯度为0.1μmol/L-10.0μmol/L作用在12-96h时段时,其作用表现为时间和剂量依赖性,有利于指导临床用药。
2)atRA对BMSCs细胞有上调CD54、CD106的作用:浓度梯度为0.01μmol/L-10.0μmol/L时,作用随药物浓度升高而增强;上调作用随时间的延长而增强,atRA作用在12小时即可发生,48-96小时达峰值平台。总之,atRA对BMSCs细胞有抑制增殖及上调黏附分子的双重作用,对临床应用及实验室研究提供了相关的试验依据及新的思路。
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