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慢性肝病是一组严重危害人类健康的疾病,基本上所有慢性肝病均有肝纤维化的病理改变,若不能加以控制或阻断进而可发展为肝硬化、或原发性肝癌。肝纤维化(Hepaticfibrosis)的病理特征是以细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)在肝脏内大量异常沉积为主。国际著名肝脏病学家Rogking明确提出人典型发展的肝纤维化是完全可以逆转,因此,尽快阐明肝纤维化的发生机制,寻找到有效逆转肝纤维化的方法或药物,成为近十年来世界肝病医学领域攻关中的热点课题。近年来,随着分子生物学技术的发展,后基因组时代的到来及微小RNA的发现,关于肝纤维化和微小RNA(miRNA)作用关系的研究报道日渐增多。miRNA是一类具有18-24个核苷酸的单链小RNA,它广泛存在于真核生物中,具有高度保守性、时序性和组织特异性,对生命过程中的一系列重要进程有决定性调节意义。miR-200家族(miRNA200s)由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429共5个成员组成,大量研究证实miRNA200s可通过调节如锌指E盒结合蛋白(zinc-fingerE-box-bindinghomeobox,ZEB)等核转录调节因子参与多种细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的过程从而达到调节脏器纤维化发生发展的作用。但肝纤维化发生发展过程中EMT的发生和EMT核转录调节因子ZEB家族表达变化,以及与miRNA200s可能的的调节关系尚未见系统报道,本课题正是在此研究背景的基础上以阐明肝纤维化过程中ZEB1/ZEB2及其调节因子miR-200s表达变化及其参与调节EMT的机制为目的,同时引入对肝纤维化有明显防治作用的中药丹芍化纤胶囊作为干预,并在体外细胞水平进行了相关调节机制的研究。 第一部分:大鼠肝纤维化形成及中药丹芍化纤胶囊干预过程中EMT发生及ZEB1/ZEB2、miR-200s动态表达变化研究 目的:研究大鼠慢性肝损伤致肝纤维化及中药丹芍化纤胶囊干预过程中与上皮-间叶转化(EMT)调控相关因子微小RNA200家族成员及E盒结合锌指蛋白1,2(zinc-fingerE-box-bindinghomeobox1/2,ZEB1/ZEB2)动态表达变化。 方法:皮下注射四氯化碳(CCL4)复制大鼠慢性肝损伤致肝纤维化模型,分别在2周、4周、6周和8周处死动物,干预组在皮下注射CCL4同时给予丹芍化纤胶囊(0.5g/kg)灌胃,分别在4周、8周处死大鼠;计算肝脏指数、检测大鼠血清ALT/AST含量;光镜下观察肝脏病理结构变化;采用实时荧光定量PCR方法检测大鼠肝组织miRNA200s的表达变化;采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学方法、免疫印迹法(westernblotting)从基因及蛋白水平检测E钙粘结蛋白(E-cadherin)、平滑肌α肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、ZEB1与ZEB2的动态表达变化。 结果:模型各组及干预4周组大鼠肝脏指数、ALT及AST含量皆明显高于正常对照组(P<0.01);8周模型组大鼠肝脏光镜下可见明显肝纤维化病理改变;模型各组大鼠肝组织中α-SMA蛋白及mRNA表达量随着肝损伤及纤维化程度加重逐渐增加,而E-cadherin蛋白及mRNA表达量则逐渐降低;模型2周组中miRNA-200a、miRNA-200c、miRNA-141表达量皆明显高于正常对照组(P<0.01);模型4周组中miRNA-200a、miRNA-429表达量明显高于正常对照组(P<0.01);模型6周组中、miRNA200c、miRNA-141mRNA表达量明显高于正常对照组(P<0.01);模型8周组中miRNA-200所有成员表达量皆明显高于正常对照组(P<0.01),模型6周、8周大鼠肝脏组织中ZEB1与ZEB2蛋白(P<0.01)及mRNA(P<0.01)表达量皆明显高于正常对照组。丹芍化纤胶囊干预4周、8周组大鼠肝组织E-cadherin、α-SMA、ZEB1/ZEB2表达与同期模型组存在显著性差异(P<0.05);干预8周组大鼠肝组织内miR-200表达显著低于8周模型组(P<0.01)。 结论:EMT参与并促进了肝纤维化的发生发展;肝纤维化形成过程中EMT的发生可能是通过miRNA200s与ZEB1/ZEB2表达变化调节的;在丹芍化纤胶囊抑制肝纤维化发展过程中EMT的作用有所减轻;miRNA-200s与ZEB1/ZEB2可能是丹芍化纤胶囊抗肝纤维化作用的新靶点。 第二部分:TFG-β1诱导肝细胞EMT过程中ZEB1/ZEB2及其调节因子miRNA200s表达的变化 目的:构建转化生长因子1(TFG-β1)诱导大鼠肝细胞发生EMT的模型,并观察miRNA200s及其调节因子ZEB1/ZEB2表达变化情况。 方法:将大鼠肝细胞系BRL-3A细胞分为TGF-β1处理组和对照组,分别给予和不给予TGF-β1(6ng/ml)共培养,收集各组培养0h、24h、48h、72h等量细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-200s的表达变化;采用实时荧光定量PCR法、细胞免疫荧光法、免疫印迹法(westernblotting)从基因及蛋白水平检测E钙粘结蛋白(E-cadherin)、平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、ZEB1与ZEB2的动态表达变化。 结果:TGF-β1处理组培养24h细胞较对照组miRNA-200a、miRNA-141的表达量明显减少(P<0.05);处理组培养48h细胞miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141的表达量明显减少(P<0.05);处理组培养72h细胞miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141表达量明显减少(P<0.01);TGF-β1处理组培养24h、48h、72h细胞E-cadherin蛋白及mRNA表达量均较对照组细胞表达明显减少(P<0.05),且成逐渐减少的趋势;而α-SMA在各个时间点细胞内均未见明显表达;TGF-β1处理组培养24h、48h、72h细胞较对照组ZEB1蛋白及mRNA表达量均明显增加(P<0.01),处理组培养48h、72h细胞较对照组ZEB2蛋白及mRNA表达量均明显增加(P<0.05)。 结论:TGF-β1可诱导大鼠肝细胞上皮极性消失,促进肝细胞EMT的发生;miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141在TGF-β1诱导肝细胞EMT的过程中表达下调;TGF-β1诱导肝细胞EMT过程中ZEB1/ZEB2表达增加可能是通过TGF-β1直接激活及miRNA200s表达下调对其抑制作用减弱的双重调节效应实现的。