第一部分 化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞的体外抑制作用研究背景及目的血液肿瘤治疗一直被认为是人类不可攻克的难题。由最初的放化疗到随之兴起的造血干细胞移植,医疗技术的进步为肿瘤的治疗带来了希望。但即使是这样,仍有很多的血液肿瘤治疗效果并不理想。目前常用的治疗方法就是造血干细胞移植。但是移植前长期的化疗和放疗所带来的副作用大大的降低了患者的生存质量,移植后的复发和并发症更是使得存活率明显降低。随着移植技术的不断完善和提高,移植存活率明显升高,但仍有一部分患者移植后复发,标危患者复发率为25%～30%,高危者复发可达40%以上,复发者再移植的成功率将会明显降低。近几年以嵌合抗原受体T细胞为首的细胞免疫疗法在临床上表现出良好的治疗效果,使得广大难治性恶性血液病患者看到了希望。根据肿瘤的特异性抗原,通过制作成具有特异性的嵌合抗原受体来转入T细胞以特异性攻击那些带有与嵌合抗原受体表面标记相同分子的肿瘤细胞,如用带有CD19标记分子的嵌合抗原受体T细胞治疗急性B淋巴细胞白血病,取得了很好的治疗效果。但是因为CD19抗原的限制性导致一些相关的并发症随之出现,常见的有B细胞缺乏导致的低丙种球蛋白血症,细胞因子风暴,脱靶效应,基因克隆,肿瘤溶解综合征等等,给临床带了难题,不少患者因为并发症的出现导致治疗失败乃至引起生命危险。嵌合抗原受体T细胞输注入体内后如果作用太强就会引起细胞因子风暴,攻击患者的心脏或者肺部引起死亡。在体内作用的时间太长就会引起低丙种球蛋白血症。为了避免或者减少出现这种并发症,常常采取输注丙种球蛋白来减轻低丙种球蛋白血症,IL-6托珠单抗治疗细胞因子风暴,小剂量激素减轻发热,控制炎症反应等等,虽然取得了较好的临床效果,但是仍然有许多严重的病例得不到很好的控制,这为我们在现有的治疗方法上探讨出更新更有效的治疗方式提出了要求。虽然已经有研究者实验在第四代嵌合抗原受体T细胞上安装自杀基因以在必要时启动自杀程序清除掉自身以减轻并发症,但是目前尚处于研究阶段。而化疗药物因为其临床使用经验丰富,效果确切,似乎更容易被用来作为清除嵌合抗原受体T细胞的手段,这就是我们这个实验的出发点。临床中急性B淋巴细胞白血病最为常见,研究也最为成熟,也是目前治疗效果最好的一类疾病,所以在本实验中我们以CD19嵌合抗原受体T细胞作为我们研究的实验细胞。在移植前采取输注少量的CD19嵌合抗原受体T细胞以清除肿瘤细胞减轻肿瘤负荷,还可以发挥CD19嵌合抗原受体T细胞治疗的靶向优势从而提高移植成功率,或者在采用单纯输注CD19嵌合抗原受体T细胞治疗后给予适量的化疗药物以降低CD 19嵌合抗原受体T细胞在体内的存活时间,中止CD 19嵌合抗原受体T细胞的作用,这些都不失为解决复发和改善患者生存质量的良好方法。那么化疗药物在什么时间点给予既能够杀灭肿瘤细胞又不会对后续输注的CD19嵌合抗原受体T细胞活性产生影响?或者化疗药物在什么时间点和浓度给予下,才能达到完全清除CD19嵌合抗原受体T细胞,防止CD19嵌合抗原受体T细胞相关并发症产生的目的?这就是我们这个课题需要阐明的科学问题--探讨化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞的影响,并且明确作用的最佳时间点以及作用浓度,为制定临床治疗方案奠定理论基础。研究方法1.从正常成人外周血提取T细胞,分离后经慢病毒转染制作成带有CD19靶标的T细胞,机械分离制成单细胞悬液,以免疫细胞无血清培养基重悬细胞2.在细胞培养过程中加入含有IL-2细胞因子的培养基进行扩增,每天观察细胞增长情况,行细胞计数,然后调整细胞密度接种于96孔培养板,每孔90ul,使活细胞数量约2x105个/孔,置培养箱内培养,检测细胞表面的嵌合抗原受体率达30%以上即可使用3.加入抗肿瘤药物1Oul/孔,其浓度参照血浆峰浓度值,按不同浓度依次添加。每个浓度设3个重复孔(A加药组),同时设不加药,只加细胞和培养基的对照孔(A0加药组)及只有培养基的空白(A空白组)对照孔,继续培养24h,48h,72h和(或)96h后,每孔加入10ul的CCK8试剂,再培养适当时间,在吸光度450nm处用酶标仪检测吸光度4.计算抑制率=(A0加药组OD值-A加药组OD值)/(A0加药组OD值-A空白组OD值)*100%5.数据采用SPSS 15.0软件对实验结果进行单因素方差分析及析因设计的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.氟达拉滨在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞的抑制率随着时间的延长及浓度的增加而升高(P<0.05)。在高浓度时,作用96h后,抑制率均可达90%以上。2.白舒非在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞无抑制作用(P>0.05)。3.环磷酰胺在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞无抑制作用(P>0.05)。4.地塞米松在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞的抑制率随时间延长而升高(P<0.05)。在作用48h后抑制率达到最高峰,随后出现下降。5.马磷酰胺在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞的抑制作用随时间延长而加强,随浓度增大,抑制率增加(P<0.05)。在1Oug/ml时,72h抑制率在90%以上,从96h后开始抑制率降低。结论马磷酰胺为环磷酰胺的代谢产物,在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞有抑制作用。同时也验证了环磷酰胺进入体内,首先在肝脏进行代谢,通过代谢产物在体内发挥作用,在体外没有活性。氟达拉滨、地塞米松均对CD19嵌合抗原受体T细胞有抑制作用,且随着时间的延长,抑制率增加,作用一定时间后出现抑制率下降。本实验创新点:在体外实验中,氟达拉滨,马磷酰胺及地塞米松对CD19嵌合抗原受体T细胞具有抑制作用。第二部分化疗药物诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的信号通路研究背景和目的细胞的死亡有两种方式,分为细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是细胞的基本特征之一,是指细胞为了清除自身不需要的和失去功能的细胞的一种高级调控过程。根据起始途径不同,分为死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。它不同于细胞坏死,不是一种被动的过程,而是一个主动的过程,涉及一系列基因的表达,调控和激活,是机体为了更好的适应外界环境变化而主动采取的一种死亡过程。可以发生在细胞生长、衰老、当细胞受到疾病和毒害因素的破坏时,例如受到放射性药物或者化学药物化疗刺激等的过程中。凋亡细胞在发生凋亡时会产生诸多重要改变,包括细胞收缩,体积变小,连接消失,与周围的细胞脱离,然后细胞质密度增加,线粒体膜电位消失,通透性改变,释放细胞色素C到胞浆,核质浓缩,核膜核仁破裂,DNA降解,细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面,导致细胞内主要物质的分离以形成凋亡小体,被巨噬细胞或者薄壁组织细胞所吞噬的现象发生。而细胞坏死是细胞受到强烈的理化或者生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大,胞膜破裂,细胞内容物外溢,核变化较慢,DNA降解不充分,引起局部严重的炎症反应。虽然随着生物技术的进步,使得我们对凋亡的认识越来越深入,但是对于它的确切机制仍然有许多需要我们去进行深究的地方。细胞的凋亡在机体的胚胎发育、组织修复、维持体内正常代谢等方面起着十分重要的作用,很多细胞生物学研究均需要检测细胞的凋亡。不同的外界因素引起凋亡的途径也不一致,在三大途径中,我们常以线粒体途径为最常见,也最为重要。我们的前阶段实验结果提示,在体外氟达拉滨,马磷酰胺及地塞米松对CD19嵌合抗原受体T细胞有不同程度的抑制作用。那么这些药物到底通过什么样的途径去发挥作用,它的作用机制是什么,这就是本实验的主要研究目的。我们通过采用Annexin V/PI凋亡试剂盒以流式方法检测CD19嵌合抗原受体T细胞表面细胞膜的磷脂酰丝氨酸是否外翻来观察CD19嵌合抗原受体T细胞的早期凋亡,以JC-1探针检测CD19嵌合抗原受体T细胞线粒体膜电位的变化再次验证凋亡的发生,并同时检测CD19嵌合抗原受体T细胞胞浆中Caspase3/7酶浓度的变化来观察凋亡发生的动态过程,探讨化疗药物诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的信号通路。方法1.氟达拉滨浓度为12.50ug/ml,马磷酰胺浓度为1Oug/ml,地塞米松浓度为5ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用24h后采用Annexin V/PI双染法检测细胞的早期凋亡率2.氟达拉滨浓度12.5ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用24h,马磷酰胺浓度为10ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用12h,利用JC-1荧光探针检测细胞膜电位的变化3.氟达拉滨浓度为12.5ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用24h,马磷酰胺浓度为1Oug/ml与CD19嵌合抗原受体T细胞共孵育6h,用流式细胞仪检测Caspase-3/7酶的浓度。采用SPSS15.0统计软件对实验结果进行析因设计资料的方差分析,配对样本T检验及单向方差分析,P<0.05为有统计学意义。结果1.经过氟达拉滨及马磷酰胺处理过的CD19嵌合抗原受体T细胞相对于未经处理过的细胞,凋亡率明显增加(P<0.05)。2.经过氟达拉滨及马磷酰胺药物处理的CD19嵌合抗原受体T细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05)。3.经过氟达拉滨及马磷酰胺处理后的CD19嵌合抗原受体T细胞胞内Caspase-3/7酶浓度明显增加(P<0.05)。结论通过细胞膜的翻转机线粒体膜电位的变化可以判断氟达拉滨及马磷酰胺对CD19嵌合抗原受体T细胞具有诱导早期凋亡的作用。本阶段实验的创新点:氟达拉滨及马磷酰胺有诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的作用。第三部分化疗药物对Raji细胞及Jurkat细胞的体外抑制作用研究背景和目的2015年数据报道显示,中美的实体瘤和血液肿瘤数出现明显的增长,针对血液肿瘤不同靶点的嵌合抗原受体T细胞的临床试验也是与日俱增。为了更好的研究在不同血液肿瘤疾病中化疗药物对嵌合抗原受体T细胞的作用情况,我们选取Raji细胞及Jurkat细胞作为常见疾病模型的代表,探讨化疗药物对这两种肿瘤模型作用的最佳浓度和时间,为后续进行体内验证化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞抑制作用的实验奠定理论基础。方法1.利用CCK8法检测不同数量的Raji细胞1,2,3,4,8*10E4/孔(Jurkat细胞浓度为1,2,3,4,5,6,7*10E4/孔),在1h,2h,3h,4h各时间点的OD值,绘制标准曲线,取OD值为1的细胞数作为后续实验的基本细胞数。并以此细胞数检测在24h,48h,72h,96h时,各时间点(1h,2h,3h,4h)对应的OD值,以OD值为1-2之间的时间点作为后续实验的测定时间。2.根据每种药物的血药峰浓度值,按不同浓度依次添加。每个浓度设3个重复孔(A加药组),同时设不加药,只加细胞和培养基的对照孔(A0加药组)及只有培养基的空白对照孔(A空白组),继续培养24h,48h,72h或者96h后,每孔加入10ul的CCK8试剂,按照上述实验确定的时间点,在吸光度450nm处用酶标仪检测吸光度。每组重复三次,计算抑制率=(A0加药组OD值-A加药组OD值)/(A0加药组OD值-A空白组OD值)*100%。采用SPSS15.0统计软件对实验结果进行单因素方差分析,P<0.05为有统计学意义。结果1.氟达拉滨对Raji细胞及Jurkat细胞的抑制率均随时间的延长及浓度的增加而升高(P<0.05),均在浓度为1.5625ug/ml作用72h后抑制率开始下降。2.白舒非在体外对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。3.环磷酰胺在体外对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。4.地塞米松在体外对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。5.马磷酰胺对Raji细胞及Jurkat细胞的抑制作用随时间延长而加强,随浓度增大,抑制率增加(P<0.05)。作用于Raji细胞时,在浓度为5ug/ml时,从72h开始抑制率降低。作用于Jurkat细胞时,在浓度为1.25ug/ml时,从48h开始抑制率下降。结论马磷酰胺为环磷酰胺的体外代谢产物,在体外对Raji细胞及Jurkat细胞有抑制作用。验证了环磷酰胺进入体内,首先在肝脏进行代谢,通过代谢产物在体内发挥作用,在体外没有活性。氟达拉滨对Raji细胞及Jurkat细胞有抑制作用,且随着时间延长,抑制率增加。在体外白舒非及地塞米松对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。