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研究背景:膀胱癌是全球,也是我国最常见的泌尿生殖系恶性肿瘤。膀胱癌发病率占成人恶性肿瘤的8%,分别居男性、女性恶性肿瘤的第4和第8位。膀胱癌中上皮性肿瘤占98%,而移行细胞癌占上皮肿瘤的90%以上,临床上占有重要的地位。膀胱移行细胞癌的特点是发病率高、复发率高、治疗较复杂;生物学行为多变,表浅癌容易复发、进展,侵润。对于膀胱移行细胞癌的治疗,目前困扰临床医师最大的问题就是如何减少复发,如何控制肿瘤进展。传统方法有膀胱局部灌注化疗、全身化疗、免疫治疗等,但效果都不是很理想。近年来抗癌药物治疗研究的新方向转向抑制肿瘤生长进展中特异性通路和关键分子的分子靶向治疗,而减少复发,控制肿瘤进展是膀胱移行细胞癌的靶向治疗药物的研究方向。Src(鸡肉瘤病毒基因组中的基因,sarcoma gene)是最早报道的癌基因在肿瘤的发生、发展和转移中具有重要作用。研究提示c-Src在许多上皮和非上皮恶性肿瘤都出现过度表达和活性异常,c-Src的蛋白产物—非受体蛋白酪氨酸激酶c-Src家族在众多信号传导通路中起着关键作用,影响着细胞的增殖、分化、迁移和存活,与肿瘤的发生发展、转移及预后密切相关,提示c-Src蛋白在调控细胞的生长、粘附、运动和细胞信号传导等方面发挥重要作用。研究发现膀胱移行细胞癌细胞上c-Src激酶活性明显升高。c-Src过度表达可促进膀胱移行细胞癌细胞向间质迁移,增加其浸袭潜力。因此,我们选定c-Src作为潜在的肿瘤基因治疗靶点,试图通过此项研究,了解c-Src在膀胱移行细胞癌中的表达情况,了解c-Src蛋白产物与膀胱移行细胞癌的发生、发展、转移及预后的相关性。在此基础上,研究Src酪氨酸激酶抑制剂对膀胱移行细胞癌T24细胞生长、增殖的影响,探讨酪氨酸激酶抑制剂对Src蛋白及其下游信号的作用,论证Src蛋白作为膀胱移行细胞癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性。第一章Src蛋白在膀胱移行细胞癌(BTCC)上的表达及其意义目的:探讨c-Src蛋白在膀胱移行细胞癌(BTCC)上的表达及其意义方法:用半定量RT-PCR的方法检测36例膀胱移行细胞癌(BTCC)中c-Src的表达情况,并分析其与膀胱移行细胞癌(BTCC)临床病理因素的关系。同时取癌旁组织22例及正常膀胱组织18例做对照。结果:BTCC(分浅表性膀胱癌和肌层侵润性膀胱癌两组)组织中c-SrcmRNA表达比值(c-Src/β—actin)分别为0.311±0.014、0.252±0.024,明显高于癌旁组织中的0.150±0.032和正常膀胱组织的0.144±0.028,组间存在显著差异(P＜0.05)。c-Src在复发患者中的表达比值(c-Src/β-actin)为0.329±0.103,明显高于初发患者中的表达比值(c-Src/β-actin)0.288±0.121,组间存在显著差异(P＜0.05)具有统计学意义;c-Src在膀胱移行细胞癌(BTCC)G1、G2、G3组其表达比值(c-Src/β-actin)分别为0.289±0.128,0.302±0.104和0.325±0.098存在明显差异,G1组、G2分别与G3组比较,组间存在显著差异(P＜0.05)具有统计学意义。结论:1、c-Src及其蛋白在膀胱移行细胞癌(BTCC)存在明显高表达。2、c-Src及其蛋白的表达的强度与膀胱移行细胞癌(BTCC)的分化和分期密切相关,肿瘤分化越低、临床分期越晚以及复发患者,c-Src及其蛋白的过表达越明显,据此推测c-Src的过表达或高表达可能与膀胱移行细胞癌的侵袭、复发和转移密切相关。第二章Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对人膀胱移行细胞癌T24细胞生长、增殖的细胞生物学研究目的:了解Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对人膀胱癌T24细胞的抑制作用,诱导细胞凋亡的效果及对其迁移能力影响。方法:运用Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ干预人膀胱癌T24细胞的体外生长,显微镜观察法观察T24细胞干预前后的生长情况,MTT法检测存活率,Hoechst染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡,流式细胞计数(AnnexinⅤ/PI双染法)检测凋亡比率,Transwell肿瘤细胞迁移实验来了解Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对T24细胞迁移的影响。结果:Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对人膀胱癌T24细胞有抑制作用,并且呈明显的剂量效应关系。Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ能够诱导T24细胞凋亡,凋亡比率呈剂量依赖性关系。经Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ干预后透过人工基底膜的T24细胞明显减少。结论:Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对能够抑制或减弱人膀胱癌T24细胞的生长、增殖、迁移/侵袭/转移的能力,诱导T24细胞凋亡。第三章Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对人膀胱移行细胞癌T24细胞生长、增殖影响的分子生物学机理探讨目的:探讨Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对Src蛋白及其下游信号的作用。方法:半定量RT-PCR法检测Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ处理后的人膀胱癌细胞T24各浓度组的c-Src、E-Cadherin、P38MAPK、MMP9基因表达的变化情况,使用Western blot检测Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ处理后T24细胞内的c-Src蛋白(包括其磷酸化与非磷酸化两种类型)表达情况。结果:Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ处理有下调后的人膀胱癌细胞T24各浓度组的c-Src mRNA的表达有下调;E-Cadherin基因的表达呈逐渐上调趋势;P38基因的表达呈逐渐下调趋势;MMP9基因的表达有下调。处理后T24细胞内c-Src基因在蛋白表达水平上其磷酸化类型随Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ浓度的增高表达逐渐下降,并且呈剂量效应关系。结论:1 Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ可能通过竞争Src蛋白磷酸化位点,使其不能激活,从而导致下游的细胞传导途径失活使得T24细胞增殖得到抑制,认为Src蛋白具有作为膀胱移行细胞癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性。2 Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ特异性地阻止Src蛋白磷酸化后使得E-钙粘连蛋白表达上调,活性增高,从而使人膀胱癌T24细胞间依赖于钙粘连蛋白的细胞间粘连增强,致使细胞向外侵润、迁移能力下降。3 Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ可能可以通过阻止Src蛋白激活影响其下游的Ras/Raf/MEK/MAPK(ERK1/2或p38)通路和ERK1/2和p38细胞信号传导通路,下调p38表达不仅直接和间接的诱导T24细胞凋亡,而且可以阻止或减少T24细胞的迁移、扩散和穿膜侵袭的发生。4 Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ可能通过影响C-Src介导的AP-1位点下游的GT盒对MMP-9基因的转录启动子发挥作用来实现其在转录水平上对MMP9的表达调节,使得MMP9基因在mRNA表达水平上下调,从而抑制T24细胞的增殖,诱导T24细胞凋亡,抑制或减弱人膀胱癌T24细胞的迁移/侵袭/转移的能力。