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山胡椒(Lindera glauca),系樟科山胡椒属(Lindera Thunb.)的芳香植物,广泛分布于中国秦岭及淮河以南各个省区,其果实中含有大量芳香油,可供于食用和药用,极具开发利用价值。本研究基于实验室前期获得的山胡椒果实转录组数据,对其进一步注释和筛选得到参与萜类前体物质丙酮酸转运的两个基因LgBASS2和LgMPC2,开展其全长序列克隆及表达载体构建与遗传转化拟南芥研究,进而通过对质体LgBASS2和线粒体LgMPC2转基因拟南芥植株的表型和基因表达分析,探究两种丙酮酸转运蛋白对山胡椒果实萜类合成代谢的影响;同时,开展基于染色体步移技术的LgBASS2基因启动子序列克隆及其顺式作用元件的预测分析,通过重组植物表达载体构建以及烟草瞬时转化和GUS组织化学染色分析,以期明确LgBASS2基因启动子的组织表达特性和顺式作用元件种类。通过上述研究,可得到如下主要结果:1.成功克隆得到山胡椒果实的丙酮酸转运蛋白基因LgBASS2和LgMPC2,两者序列长度分别为1,251 bp和327 bp;借助生物信息学手段和相关软件,分别对二者的核酸序列和编码蛋白的氨基酸进行分析,并对基因编码蛋白与其他物种进行同源性比对和系统进化分析。结果表明,二者核酸序列含有最多的核苷酸分别为T和A,编码蛋白的二级结构均以α-螺旋为主,亲缘关系分别与沉水樟(Cinnamomum micranthum)和海枣(Phoenix dactylifera)较近。2.构建含有LgBASS2和LgMPC2基因的植物表达载体,以农杆菌介导花序侵染方法分别转化拟南芥野生型植株;经过抗性筛选及分子检测与生物统计分析,获得转基因植株并筛选得到纯合株系;通过对转LgBASS2和LgMPC2基因拟南芥植株分别进行表型观察后发现,与野生型拟南芥相比,转LgBASS2株高和种子干重均有所下降,而转LgMPC2拟南芥的株高和种子干重却均有所增加,说明LgBASS2和LgMPC2基因表达对拟南芥生长发育有一定影响。另外,对转基因植株的LgBASS2和LgMPC2基因及萜类合成代谢相关的关键功能基因进行荧光定量检测,结果表明,LgBASS2和LgMPC2基因表达量在转基因植株发育过程中呈现前期上调而后期下调的表达模式,与野生型相比,但大部分萜类合成相关的基因(如ACCT、HMGS DXS、CMK、MK和HMGR)在转LgBASS2和LgMPC2基因拟南芥果荚发育中均呈现出不同程度的上调表达模式。此外,构建GFP融合表达载体瞬时转化烟草,并对LgBASS2和LgMPC2基因进行亚细胞定位,进而确定两个基因分别定位于质体膜和线粒体内膜中。3.根据已经克隆得到的转运蛋白LgBASS2基因设计特异性引物,以山胡椒果实的DNA为模板,利用染色体步移技术克隆得到LgBASS2基因启动子序列,进而运用PlantCARE等生物信息学分析软件对启动子潜在的各类调节元件进行预测。结果发现,LgBASS2启动子除存在高等植物核心调控元件(CAAT-box和TATA-box),还包括光响应以及赤霉素响应和逆境响应等重要顺式作用元件(例如LTR、GARE-motif、P-box、GT1-motif、GATA-motif 和 ATCT-motif 等)。4.利用GUS基因作为报告基因,成功构建LgBASS2启动子驱动GUS基因的植物表达载体并进行农杆菌瞬时转化烟草试验。GUS染色分析显示,LgBASS2启动子的GUS基因在转化烟草的根、茎、叶片和花各组织中均有表达,初步确定LgBASS2启动子为组成型启动子。本研究结果可为山胡椒果实精油累积分子机理研究和种质资源挖掘利用奠定基础,并可为后续开展LgBASS2启动子功能研究提供科学依据。