研究背景牙周炎(Chronic periodontitis, CP)是最常见的口腔慢性感染性疾病,主要临床表现是牙龈炎症和牙槽骨病理性吸收。牙周病病因复杂,涉及感染、免疫、年龄、种族、遗传背景、心理及环境因素等,但发病机制尚不明确。牙周致病菌及其所引起的细胞免疫,尤其是CD4+辅助性T细胞(T helper,Th细胞)能够通过多种途径介导炎症反应、宿主免疫应答及抗感染反应。在、Th细胞分化机制的研究中发现,初始Th0细胞接受局部微环境激活信号后,选择性的向不同方向极化,各自分泌不同种类细胞因子,被分别命名为Th1、Th2、Thl7和Treg细胞,相互影响、相互制约、形成网络维持动态平衡。Th1、Th2之间的平衡状态被认为是维持全身免疫系统内环境稳定的重要因素。新近发现的辅助性T细胞17型(T helper17, Th17)以分泌促炎因子IL-17为特征,需要STAT依赖的特异性转录因子维甲酸相关孤核受体(retinoid-related orphan nuclear receptor γt, RORγt)参与,启动其增殖和分化过程,具有独立的调节机制,在多种自身免疫性疾病的致病机制中发挥重要作用。Th17细胞的功能特性激发了研究者对其与牙周疾病发生发展的联系的探讨,是对经典Th1/Th2细胞免疫模型的补充。此外,Th17细胞存在至少两种表型,单一表达分泌IL-17的经典活化Th17细胞(IL-17+Thl7细胞),以及同时分泌IFN-γ和IL-17的选择性活化Th17细胞(IL-17+IFN-γ+Th17细胞,即Th1/Th17细胞)。两种表型的Th17细胞,在因子表达、效应功能和致病性方面存在差异。我们的实验思路,主要从临床研究和体外细胞实验两个方面展开,首先采用流式细胞术检测并比较慢性牙周炎和牙周健康者外周血中Th1、Th2和Th17细胞及选择性活化Th1/Th17的分布水平。两组人群血浆和龈沟液标本中,Th亚群细胞相关细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF和IFN-γ的浓度水平的差异。其次,免疫组化分析Thl和Th17细胞在牙周炎病损局部的表达情况。同时,对牙龈组织中Thl和Th17特征性细胞因子IFN-γ、IL-17和特异性转录子T-bet和RORyt的mRNA水平进行检测。最后,体外利用破骨前体细胞系RAW264.7作为研究模型,将Thl7两种表型细胞两种特征性分泌细胞因子IL-17和IFN-γ联合作用,探讨其在破骨前体细胞成为破骨细胞过程中,对增殖、分化、凋亡的影响并分析可能的机制。该研究有机联系了免疫因素与牙周炎的发病机制,为临床寻找牙周炎治疗的新思路提供科学的理论依据。因此,本研究分三个部分。第一部分：慢性牙周炎患者Th1、Th2和Th17细胞及其细胞因子表达差异的研究目的：探讨慢性牙周炎患者Th1、Th2和Th17细胞及特征性细胞因子的分布特点。方法：通过流式细胞术检测慢性牙周炎和牙周健康者外周血Th1、Th2和Th17细胞的分布差异。流式液相多重蛋白定量技术进一步分析两组部分人群中血浆和龈沟液标本中,Yh细胞亚群相关细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF和IFN-y水平的表达差异,并统计分析因子间相关关系。结果：轻、中度慢性牙周炎组中,Thl:13.2±6.91%、Th2:2.2±1.96%、Th17：0.95±0.84%；重度慢性牙周炎组,Thl:16.6±1.07%、Th2:2.06±1.17%、Th17:1.39±0.9%；健康组Thl:8.22±4.50%、Th2:1.19±1.15%、Th17:0.62±0.49%。统计学分析数据显示,轻、中、重度慢性牙周炎组Thl和Th17在外周血中的比例均高于健康组,差异有统计学意义(F值分别为10.98、6.49,P<0.05)。对Th2细胞,轻、中度慢性牙周炎组和健康对照的差异有意义,而重度牙周炎组,细胞比例升高,但差异无统计学意义。细胞因子的水平显示在慢性牙周炎组血浆中IL-17的浓度高于牙周健康的对照组(9.02±14.21pg/ml vs4.43±6.14pg/ml, P<0.05)。其他细胞因子浓度在牙周炎组有升高的趋势,但不具有统计学差异(P>0.05)。龈沟液中细胞因子在两组间的差异,未发现有统计学意义。结论：慢性牙周炎患者血浆中IL-17较牙周健康者升高,提示IL-17可能是牙周炎发生重要的促炎症细胞因子。慢性牙周炎患者体内存在Thl细胞和Th17细胞数量的升高,相关分析显示存在正相关关系,推测两种T细胞亚群可能共同发挥致病作用。第二章Thl和Th17细胞在牙周炎病损组织中的分布及IL-17+IFN-γ+Th17细胞与慢性牙周炎的关系目的：探讨慢性牙周炎病损局部的Thl和Th17与正常相比,是否存在差异。检测慢性牙周炎患者外周血中Th17亚型细胞IL-17+IFN-γ+Th17的分布特点。方法：收集因牙周炎拔除的患牙牙龈组织作为病例组,选择颌面外科门诊拔除的阻生牙或冠延长患者的正常牙龈组织作为对照,通过免疫组化及实时荧光定量PCR检测IL-17、IFN-γ、T-bet、RORyt的表达水平。在第一部分流式检测的基础上,进一步分析慢性牙周炎患者外周血中IL-17+IFN-γ+Th17细胞的百分比水平和组间检出率的分布特点。结果：牙周组织中IL-17和IFN-γ细胞的H-scorce评分,显示慢性牙周炎组高于牙周健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。定量PCR结果显示,牙周炎组IL-17、IFN-γ和T-bet mRNA表达高于正常组(P<0.05),而RORyt水平未显示差异。IL-17+IFN-γ+Thl7细胞在轻、中度组和重度组慢性牙周炎CD4+T细胞中所占比例较正常组有升高趋势,组间的细胞检出率分别为48.84,56.6和33.33%,然而组间差异无统计学意义。结论：Thl及Th17参与了慢性牙周炎局部的炎症反应。IL-17+IFN-γ+Th17亚型细胞与牙周炎关系还有待进一步明确。第三章IL-17和IFN-γ对破骨前体细胞系RAW264.7增殖、分化和凋亡的影响目的：IL-17和IFN-γ在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中发挥重要作用。本研究旨在探讨将两者联合作用对破骨前体细胞增殖、分化、凋亡功能的影响。方法：采用RANKL和M-CSF刺激破骨前体细胞系RAW264.7培养24小时后,将IL-17, IFN-γ单独和IL-17联合IFN-γ干预细胞培养。采用CCK-8, TRAP活性试剂盒,流式细胞技术及实时荧光定量PCR,分别评价对破骨前体细胞增殖、分化、凋亡功能的差异。结果小鼠RAW264.7细胞在50ng/mlRANKL和30ng/ml M-CSF的作用下可分化为破骨细胞,在体外建立破骨细胞研究模型,用于细胞因子的研究。IFN-γ通过Fas/FasL信号途径而诱导破骨前体细胞的凋亡。而IL-17则具有抑制IFN-γ所导致的破骨前体细胞凋亡的作用,刺激更多的破骨细胞生成,推测可能和牙槽骨的吸收有关。结论：Th1/Th17的特征细胞因子IL-17联合IFN-γ对破骨前体细胞的凋亡抑制作用,提示其在牙周炎骨改建中发挥关键作用。