【摘 要】
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癌症是威胁人类健康的重大疾病之一,免疫系统可以识别并消除癌细胞,但会受到抑制性受体（Inhibitory receptor,IR）和配体的影响。机体在正常情况下,免疫检查点（Immune checkpoint）可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受,但是机体在受到肿瘤侵袭时,肿瘤细胞通过异常激活免疫检查点,抑制机体对肿瘤细胞免疫监视和清除,实现肿瘤细胞的增殖和逃逸。阻断免疫检查点的药物,可以
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癌症是威胁人类健康的重大疾病之一,免疫系统可以识别并消除癌细胞,但会受到抑制性受体（Inhibitory receptor,IR）和配体的影响。机体在正常情况下,免疫检查点（Immune checkpoint）可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受,但是机体在受到肿瘤侵袭时,肿瘤细胞通过异常激活免疫检查点,抑制机体对肿瘤细胞免疫监视和清除,实现肿瘤细胞的增殖和逃逸。阻断免疫检查点的药物,可以解除肿瘤对免疫的抑制、激活或者启动机体自身的免疫功能,进而帮助患者抑制、杀伤肿瘤细胞。近年来,以PD-1（Programmed cell death protein 1）/PD-L1（Programmed cell death 1 ligand 1）为代表的免疫检查点阻断剂在市场上掀起了巨大风浪,但仍有许多处在临床试验的免疫检查点抑制剂不为我们所认知。LAG-3分子是Frédéric Triebel 1990年发现的免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白,表达于多种免疫细胞亚型,包括T细胞、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞（DCs）、和B细胞。最新研究表明该分子可以负向调控CD8+和CD4+T细胞的增殖从而激活效应功能,是目前免疫检查点二代靶点中,临床数据较多、与PD-1联用效果明显的靶点,针对该靶点的抗体药物将来有可能成为重要的抗肿瘤药物。LAG-3与CD4具有结构上的同源性,并都与组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类结合,LAG-3凭借Domain1结构中由30个氨基酸组成的额外环亲和力远远高于CD4。本论文以LAG-3分子D1上的额外环为靶点,合成多肽作为免疫原免疫新西兰公兔。分离免疫过的兔PBMC细胞后,利用流式细胞仪分选出能够识别免疫原多肽的B淋巴细胞。利用单个B细胞克隆技术制备LAG-3兔单克隆抗体,成功调取其抗体的轻重链可变区序列,并通过同源重组的方法将调取的序列构建到抗体表达载体上,利用Expi293?真核表达系统表达纯化,最后得到8株抗体。利用ELISA检测其OD450的读值,将其拟合得到抗体的EC50,其中EC50最高为0.001224,最低为0.00002479。Western blot检测发现这8株抗体均可识别重组的人源LAG-3蛋白,部分可以识别激活后人的PBMC细胞中的LAG-3蛋白,流式细胞结果表明部分可以识别内源的LAG-3。以上结果说明目前已经筛选出亲和力高,特异性强的LAG-3兔单克隆抗体,得到该分子的单克隆抗体,对后续继续优化、人源化及临床应用的研究开发具有重要意义。
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