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目的:破骨细胞(osteoclast,OC)是一类具有噬骨功能的成熟多核细胞,因其具有明显的骨吸收作用,在人体内能够调解骨量、稳定骨重塑。传统中药巴戟天的提取物水晶兰苷(Monotropein,MTP)具有抗炎、抗氧化作用。最近的研究发现,通过给予一定浓度的MTP能缓解去卵巢小鼠的骨丢失程度,提示该药物可能具有潜在的抗骨吸收能力。因此,本实验将通过研究MTP在体外对OC的调节作用,并尽可能阐明其作用机制,旨在为治疗OC异常活跃引发的相关疾病提供有效、可靠的方法。
方法:本实验通过建立体外培养核因子κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBLigand,RANKL)诱导的RAW264.7细胞(小鼠来源的巨噬细胞系),实验采用分组设计方式,并分为空白对照组和药物组。通过MTT实验测定不同浓度下MTP对OC生成的毒性作用。此外,筛选并确定安全剂量范围,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察不同浓度的MTP对OC生成的影响。同时,采用Corning骨微孔板和细胞骨架实验检测不同浓度下水晶兰苷对OC的骨吸收功能影响。此外,由于c-Fos和活化T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1,NFATc1)的表达水平主要负责OC的分化,因此应用PCR检测手段测定不同浓度下MTP对c-Fos和NFATc1表达水平的影响。随后,通过蛋白质印迹法(western blot,WB)技术检测c-Fos和NFATc1表达水平。
结果:MTT实验结果显示,与空白对照组相比,各浓度组(10μM、20μM、50μM、100μM)的MTP对OC的生成无毒性作用,实验结果无计学意义(P>0.05)。TRAP染色结果显示,与空白对照组相比,当MTP浓度达到10μM、20μM、50μM时,对OC的生成有显著抑制作用,且在设定范围内,浓度越高,抑制效果越明显,实验结果有统计学意义(P<0.05)。骨吸收功能实验结果显示,与空白对照组相比,在多种浓度下的MTP(10μM、20μM、50μM)对OC的骨吸收功能具有有效的抑制作用,在设定范围内,浓度越高,抑制效果越明显,实验结果有统计学意义(P<0.05)。与骨吸收实验一致,OC在细胞骨架实验中呈剂量依赖性的抑制趋势。PCR实验结果显示,与空白对照组相比,20μM水晶兰苷对c-Fos的mRNA相对表达水平在给药后的12h、24h具有明显抑制作用,而NFATc1的mRNA相对表达水平在给药后的24h、48h被显著抑制。且在设定范围内,浓度越高,抑制效果越明显,实验结果有统计学意义(P<0.05)。WB的结果也表明相比较空白对照组,在20μMMTP浓度下,不同时间点内c-Fos和NFATc1的蛋白表达水平也有所下降。
结论:MTP对体外RANKL诱导OC生成和骨吸收功能的抑制效果可能是通过浓度依赖性的方式产生的,且MTP对OC生成和功能的抑制作用可能是伴随着下调c-Fos和NFATc1而产生的。这有益于今后对抑制OC活性的相关药物开发应用提供一种新的选择。
方法:本实验通过建立体外培养核因子κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBLigand,RANKL)诱导的RAW264.7细胞(小鼠来源的巨噬细胞系),实验采用分组设计方式,并分为空白对照组和药物组。通过MTT实验测定不同浓度下MTP对OC生成的毒性作用。此外,筛选并确定安全剂量范围,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察不同浓度的MTP对OC生成的影响。同时,采用Corning骨微孔板和细胞骨架实验检测不同浓度下水晶兰苷对OC的骨吸收功能影响。此外,由于c-Fos和活化T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1,NFATc1)的表达水平主要负责OC的分化,因此应用PCR检测手段测定不同浓度下MTP对c-Fos和NFATc1表达水平的影响。随后,通过蛋白质印迹法(western blot,WB)技术检测c-Fos和NFATc1表达水平。
结果:MTT实验结果显示,与空白对照组相比,各浓度组(10μM、20μM、50μM、100μM)的MTP对OC的生成无毒性作用,实验结果无计学意义(P>0.05)。TRAP染色结果显示,与空白对照组相比,当MTP浓度达到10μM、20μM、50μM时,对OC的生成有显著抑制作用,且在设定范围内,浓度越高,抑制效果越明显,实验结果有统计学意义(P<0.05)。骨吸收功能实验结果显示,与空白对照组相比,在多种浓度下的MTP(10μM、20μM、50μM)对OC的骨吸收功能具有有效的抑制作用,在设定范围内,浓度越高,抑制效果越明显,实验结果有统计学意义(P<0.05)。与骨吸收实验一致,OC在细胞骨架实验中呈剂量依赖性的抑制趋势。PCR实验结果显示,与空白对照组相比,20μM水晶兰苷对c-Fos的mRNA相对表达水平在给药后的12h、24h具有明显抑制作用,而NFATc1的mRNA相对表达水平在给药后的24h、48h被显著抑制。且在设定范围内,浓度越高,抑制效果越明显,实验结果有统计学意义(P<0.05)。WB的结果也表明相比较空白对照组,在20μMMTP浓度下,不同时间点内c-Fos和NFATc1的蛋白表达水平也有所下降。
结论:MTP对体外RANKL诱导OC生成和骨吸收功能的抑制效果可能是通过浓度依赖性的方式产生的,且MTP对OC生成和功能的抑制作用可能是伴随着下调c-Fos和NFATc1而产生的。这有益于今后对抑制OC活性的相关药物开发应用提供一种新的选择。