Streptomyces alboflavus TD-1产帕马霉素对黄曲霉的抑制及在玉米储藏中的应用

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我国作为粮食生产大国,粮谷类食品原料在田间、贮藏期及运输过程中受到黄曲霉等霉菌的污染不可避免。目前,利用生物法来对黄曲霉等霉菌污染进行防治更安全、高效、环保。本文以分离于土壤中的白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1为研究对象,对其代谢产生的活性物质帕马霉素进行分离,研究帕马霉素对黄曲霉2219等霉菌生长的抑制效果及抑制机理,并研究了白黄链霉菌TD-1对储藏期玉米的防霉效果,探寻链霉菌作为生防菌的潜能。本研究对开发具有自主知识产权的新型生物防霉剂,对降低我国粮食损失、防止食品原料受到霉菌及毒素污染,保证食品安全均具有重要意义。主要研究结果如下:(1)采用滤纸片法研究了白黄链霉菌TD-1无细胞发酵液对黄曲霉2219、灰霉、哈茨木霉、米曲霉、桔青霉、黑曲霉生长的抑制效果。白黄链霉菌TD-1无细胞发酵液对黄曲霉2219和黑曲霉抑制作用最强,对其菌落生长抑制率均高于50%;对灰霉、哈茨木霉、米曲霉和桔青霉的抑制效果良好,抑制率在25%-50%之间。(2)采用薄层色谱、硅胶柱层析、高效液相色谱和液相-质谱联用等技术对白黄链霉菌TD-1上清液和菌丝体中的活性物质进行了分离鉴定,分子式预测为C35H61NO7,为帕马霉素及其同系物,相对分子质量为593,607,621,635,649。对分离帕马霉素的硅胶柱层析洗脱剂进行了优化,当乙酸乙酯:正己烷:二异丙胺=1:80:0.5的洗脱剂用量为30 m L时,可洗脱86.17%的帕马霉素,纯度为84.43%。帕马霉素为偏酸性物质。(3)测定了帕马霉素的稳定性。采用高效液相色谱法对帕马霉素在不同保存时间、保存温度、保存状态下含量的稳定性进行了测定。帕马霉素适宜在干燥状态下、-20℃保存,随时间发生降解,第7天时含量减少37.03%,后趋于稳定。另外,将帕马霉素分别经过热处理、酸碱处理和紫外光照射处理后进行抑制黄曲霉2219实验,测定帕马霉素活性的稳定性。结果表明,帕马霉素热稳定性好,经121℃处理30 min后,仍具有较强的抑菌活性;酸碱处理后帕马霉素抑菌活性下降;紫外线稳定性好,紫外灯照射5 h其抑菌活性仍未减弱。(4)采用96孔板微量稀释法测定了帕马霉素对黄曲霉2219等霉菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。帕马霉素对桔青霉的MIC为0.125mg/m L,对灰霉菌MIC为0.5 mg/m L,对黄曲霉2219、黑曲霉、哈茨木霉和米曲霉的MIC均为1 mg/m L。通过扫描电子显微镜观察帕马霉素处理后的霉菌细胞形态,其孢子和菌丝体会发生不同程度上的畸变。通过测定霉菌细胞壁、细胞膜和线粒体的完整性以及麦角甾醇含量,研究了帕马霉素对黄曲霉2219等霉菌的抑制机理。帕马霉素对霉菌的作用靶点为真菌细胞膜的麦角甾醇。抑制机制是破坏细胞壁的完整性,改变细胞膜的通透性,影响线粒体的能量代谢,抑制菌丝细胞膜中麦角甾醇的生物合成。可以抑制98.24%的黄曲霉毒素B1合成。(5)利用白黄链霉菌TD-1发酵液对玉米进行了黄曲霉2219侵染实验。当TD-1浓度(菌丝体在发酵液总体积中的占比)为35%时,对侵染玉米的黄曲霉2219开始发挥抑制作用。此外,在储藏10 d内,白黄链霉菌TD-1发酵液对玉米中水分含量的变化没有影响,脂肪酸值上升趋势缓慢,发芽率下降不明显。
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