【摘 要】
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目的 利用生物信息学技术对人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）的包膜糖蛋白g H和磷酸化蛋白65（PP65）进行综合预测分析得到两个蛋白的线性B细胞优势抗原表位、CD8+T细胞优势抗原表位以及CD4+T细胞优势抗原表位。将抗原表位合成多肽分别在细胞和动物水平对合成的多肽进行免疫原性验证,从而为HCMV亚单位疫苗的研究提供有一定理论依据的抗原表位。方法 1、使用Pro
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目的 利用生物信息学技术对人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）的包膜糖蛋白g H和磷酸化蛋白65（PP65）进行综合预测分析得到两个蛋白的线性B细胞优势抗原表位、CD8+T细胞优势抗原表位以及CD4+T细胞优势抗原表位。将抗原表位合成多肽分别在细胞和动物水平对合成的多肽进行免疫原性验证,从而为HCMV亚单位疫苗的研究提供有一定理论依据的抗原表位。方法 1、使用Prot Param、Prot Scale、SOPMA等共11个生物信息学软件,对HCMV g H和PP65蛋白的理化性质、结构功能、线性B细胞抗原表位、CD8+T细胞抗原表位和CD4+T细胞抗原表位进行预测,得到抗原表位后通过生物合成技术合成多肽共13条,根据生物学特性用合适的溶剂将其溶解。分别通过体外和体内实验检测合成多肽的免疫激活效果。2、体外实验将人单核细胞系U937通过佛波酯（Phorbol myristate acetate,PMA）诱导为巨噬细胞,用于评价合成多肽对抗原提呈细胞的激活作用。用不同浓度的PMA及不同处理时间诱导U937细胞,通过镜下观察细胞形态变化以及利用流式细胞分析技术检测巨噬细胞表面激活标志物CD11b的表达情况,从而确定最佳的诱导条件。通过细胞毒性（CCK-8）试验检测不同诱导条件对U937细胞的细胞毒性。在巨噬细胞中加入浓度为50μg/ml的多肽,无多肽组为阴性对照组,培养24h后,以流式细胞术检测M1型巨噬细胞表面激活标志物CD86的表达,探究每条多肽对巨噬细胞的免疫激活效果。3、体内实验将鸡卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）与弗氏佐剂混合制备的疫苗设为阳性组,g H蛋白多肽、PP65蛋白多肽、g H蛋白多肽+PP65蛋白多肽以及灭活的HCMV与弗氏佐剂混合制备的疫苗设为实验组,生理盐水组设为阴性组,生理盐水与佐剂混合组设为佐剂对照组,用肌肉注射的方式对小鼠进行三次免疫,第一次免疫所用佐剂为弗氏完全佐剂（Freund’s Adjuvant Complete,FCA）,第二次和第三次免疫用弗氏不完全佐剂（Freund’s Adjuvant Incomplete,FICA）,分别于第1、3、5周进行免疫。末次免疫1周后取小鼠脾脏,处理得到脾细胞悬液后,通过流式细胞分析技术对T细胞表达干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-4（IL-4）的情况进行检测。结果 通过生物信息学软件预测,g H蛋白和PP65蛋白优势抗原表位的氨基酸位点如下:g H蛋白线性B细胞优势抗原表位氨基酸位点179-194、383-398和526-541,PP65蛋白线性B细胞优势抗原表位氨基酸位点382-397和463-478;g H蛋白CD8+T细胞优势抗原表位氨基酸位点719-727,PP65蛋白CD8+T细胞优势抗原表位氨基酸位点495-503;g H蛋白CD4+T细胞优势抗原表位氨基酸位点236-250、340-354和707-721,PP65蛋白CD4+T细胞优势抗原表位氨基酸位点45-59、110-124和287-301。细胞诱导实验的结果表明,PMA在浓度为100ng/ml、处理48h时诱导U937细胞成为巨噬细胞的效果较好,CCK-8实验结果显示此诱导条件下没有细胞毒性。实验表明,合成多肽在体外均可激活巨噬细胞;g H蛋白或PP65蛋白的合成多肽联合佐剂免疫小鼠,均能有效增强CD4+T细胞和CD8+T细胞反应,刺激细胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α的表达。结论 由生物信息学预测得到B、T细胞优势抗原表位,通过体外构建巨噬细胞模型,证明预测所得多肽可以在体外刺激巨噬细胞表面激活标志物CD86的表达,激活先天免疫反应,体内可刺激CD4+T细胞活化并表达相关细胞因子,也可激活CD8+T细胞产生细胞毒作用,具有良好的免疫原性,为HCMV亚单位疫苗的研究提供优势抗原表位。
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