论文部分内容阅读
背景和目的:排斥反应是器官移植术后影响移植物长期存活的最主要因素,有效地预防及治疗排斥反应一直是器官移植领域研究的重点。目前针对排斥反应的药物主要包括:激素类,钙调磷酸酶抑制剂,霉酚酸酯类和雷帕霉素等,虽然这些药物对维持移植物功能,延长移植物存活时间具有重要的作用,但仍无法避免排斥反应的发生,甚至对部分排斥反应无效,且目前这些药物大多是无选择性地抑制淋巴细胞,容易导致骨髓抑制、感染等严重并发症[1]。因此开发或探寻高效、安全的抗排斥药物始终是器官移植领域重要的研究方向。硼替佐米（bortezomib,BTZ）是一种高选择性地结合26 S蛋白酶体的抑制剂,前期主要用于多发性骨髓瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗[2,3]。近年来,随着研究的深入,发现该药物能抑制B细胞/浆细胞活化而减少抗体的生成[4],临床用BTZ治疗肾移植术后急性抗体介导排斥反应（antibody-mediated rejection,ABMR）时能显著降低患者血浆中供体特异性抗体水平,在改善移植肾功能和延长移植肾存活时间方面取得了较好的效果[4-7],这一特点使其成为了治疗移植术后抗体介导的排斥反应的重要工具。这种高效安全地针对活化细胞的特性是否适用于T淋巴细胞介导的排斥反应有待明确,众所周知,T细胞介导的排斥反应（T cell-mediated rejection,TCMR）是器官移植术后最常见的急性排斥反应类型[8-11],明确这一特性对于更大程度地挖掘该药潜能,提高治疗细胞介导排斥反应的效果具有重要的价值。有体外研究发现,BTZ可选择性抑制人外周血活化T淋巴细胞,而对静息期T淋巴细胞影响很小,探讨了BTZ治疗移植物抗宿主疾病（GVHD）的应用[12,13]。因此,如果BTZ能在治疗器官移植急性排斥反应中发挥类似的作用,将会为临床提供一种毒副作用小、抑制功能强的治疗T细胞介导排斥反应的新方法。因此,我们通过建立单向混合淋巴培养体系（mixed lymphocyte culture,MLC）和T细胞为主介导的皮肤移植排斥反应模型,观察BTZ对T细胞活化过程中的抑制作用以及对皮肤移植排斥反应的抑制作用,为拓展BTZ干预器官移植术后急性排斥反应的作用提供理论基础。方法:1.建立单向混合淋巴细胞培养体系。细胞培养24 h后加不同浓度BTZ培养12 h,CCK-8检测细胞增殖;按细胞混合培养时间分组,每组设实验组和对照组,实验组加0.01μmol/L BTZ培养12 h,流式细胞术检测T细胞的凋亡、细胞周期和活化相关表面标志CD25、CD69;Western blot（WB）检测凋亡相关蛋白裂解半胱天冬酶3（Cleaved caspase3）表达和周期蛋白D1（Cyclin D1）表达;ELISA检测细胞培养上清IL-4、TNF-α和IFN-γ含量。2.建立小鼠皮肤移植模型,受体小鼠随机分组:同种同基因组,同种异基因组和BTZ组。观察记录各组小鼠移植皮片的存活时间,并于皮肤移植术后第7天取材,HE染色观察各组小鼠移植皮肤病理,流式细胞术检测小鼠移植皮肤中CD 4+和CD 8+T细胞浸润情况,WB检测移植皮肤组织中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的表达情况。结果:1.T细胞在不同浓度的BTZ处理后的光密度值明显小于对照组（0μmol/L）,而且随着药物浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐升高（P<0.05）。除细胞未混合培养组（0 h）外,BTZ组凋亡T细胞所占百分比较对照组明显增加（P<0.05）,而未经混合培养组T细胞（静息性T细胞）的凋亡百分比无统计学差异（P=0.787）。另外,混合细胞培养时间越长,BTZ组凋亡T细胞百分比就越高（P<0.05）。WB结果显示BTZ组T细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase 3表达量也较细胞未混合培养组增加（P<0.05）。BTZ组T细胞的DNA含量在G1期百分比较对照组明显增大,而S期和G2期的百分比相对减少（P<0.05）,BTZ组T细胞的细胞周期蛋白D1表达量也较对照组明显降低（P<0.05）。除细胞未混合培养组外（0 h）,其他细胞培养组中BTZ组T细胞活化表面相关标志CD 25和CD 69较对照组细胞的表达均出现明显的下降,且CD 25表达下调比CD 69更加明显（P<0.05）。BTZ组细胞培养上清中细胞因子IL-4、IFN-γ和TNF-α浓度低于对照组。2.同基因移植组小鼠移植皮片的存活时间最长,移植皮片可完全存活,BTZ组小鼠移植皮片存活时间为15.1±0.6天,较同种异基因组小鼠移植皮片的存活时间（7.2±0.2天）明显延长（P<0.05）。HE染色病理结果显示BTZ组小鼠移植皮肤组织中炎性细胞浸润程度较同种异基因组明显减轻。BTZ组小鼠移植皮肤中CD 4+和CD 8+T细胞浸润数量较同种异基因组明显减少（P<0.05）。BTZ组小鼠移植皮肤组织中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的表达也较同种异基因组降低（P<0.05）。结论:硼替佐米可通过抑制T细胞的增殖能力以及选择性促进活化T细胞凋亡来减少同种抗原反应性T细胞的数量,同时降低T细胞相关免疫细胞因子分泌。另外,BTZ也可减少小鼠移植皮肤中炎性细胞浸润,并降低炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的表达,从而减轻急性排斥反应对移植皮肤的损伤,延长移植皮肤的存活时间。因此,我们认为BTZ可对急性TCMR或混合型排斥反应治疗具有潜在的应用价值,在器官移植领域抗排斥治疗具有良好的应用前景。