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研究背景和目的： 缺血性脑血管疾病治疗中可发生脑缺血再灌注损伤（CIRI）。CIRI是一个复杂的病理生理过程，其机制主要涉及氧自由基生成、兴奋氨基酸释放、炎症介质释放、线粒体功能障碍、一氧化氮释放、Ca2+超载，以及血管通透性改变和血脑屏障的破坏，最终导致细胞凋亡和坏死。 目前，大量研究认为氧自由基生成是导致再灌注损伤的重要因素之一。脑缺血再灌注后，由于组织细胞供氧得到改善，提供了生成自由基的原料，但是血液中清除自由基的物质尚未生成，导致自由基呈爆发性增长。过量的自由基与细胞膜上的酶、受体及其他成分结合，影响细胞膜的结构、功能和抗原特异性，导致细胞损伤和凋亡。氧自由基可攻击核酸、脂肪酸、蛋白质等造成组织细胞的损伤，引起细胞膜通透性增高、流动性降低、线粒体肿胀、溶酶体的破坏和释放，导致组织损伤。有研究认为，8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）是活性氧（ROS）攻击 DNA后形成的加合物之一。羟自由基和超氧阴离子等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子时，可生成氧化性加合物8-OHdG，使DNA分子空间结构发生改变。 PI3K-Akt信号通路是细胞内一条重要的信号转导通路，它在细胞凋亡、存活以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能。同时，氧化应激可以抑制细胞内 PI3K-Akt信号通路，诱导细胞发生凋亡。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，它主要由催化亚基 p110和调节亚基p85组成。当PI3K被激活后，能特异性催化磷脂酰肌醇3-位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质，在磷脂肌醇依赖性蛋白激酶（PDK）的协同作用下，PIP2和PIP3可与Akt结合，导致Akt从细胞浆转位到细胞膜，并促进Akt的Thr308和Ser473位点磷酸化。激活的Akt可以通过磷酸化Bad、Caspase-9、Forkhead、NF-κB等抑制细胞凋亡。脑缺血再灌注后，再灌注损伤会启动PI3k-Akt信号转导通路，使PI3K、Akt蛋白表达都大量上升，促进Akt磷酸化表达增高，对脑组织产生保护作用。有研究发现，在小鼠局灶性脑缺血前1h给予侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002后，小鼠神经行为学评分明显下降，且脑梗死面积显著增大。也有研究表明，缺血后处理可通过激活PI3K-Akt信号转导通路抑制心肌细胞凋亡。这说明在缺血再灌注后，PI3K-Akt信号通路参与了缺血再灌注损伤诱导的应激反应，并且该通路的激活可能促进神经细胞存活。 乌司他丁是从健康的成年男性尿液中提取的能抑制多种蛋白水解酶活力的蛋白酶抑制剂，其具有抑制氧自由基的释放、稳定细胞膜和溶酶体膜、抑制炎性介质释放、改善免疫功能等作用。现已被广泛应用于临床中，如休克、心肺复苏术后、器官移植及重症急性胰腺炎等。有多项研究表明，乌司他丁能减轻脑缺血再灌注导致的细胞凋亡，减轻细胞损伤等作用。也有研究指出，乌司他丁可以通过活化PI3k-Akt通过和ERK通路对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。 乌司他丁能否通过调控PI3K-Akt信号通路而对大鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用仍未见报道。因此，本研究通过制备大鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型，在缺血后给予乌司他丁预处理，通过观察大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分、脑组织梗死面积，用ELISA法检测大鼠血浆8-OHdG的含量，Western blot法检测缺血侧脑皮质PI3K-Akt信号通路相关Akt和p-Akt蛋白表达，探讨乌司他丁对脑缺血再灌注损伤的可能机制，为临床应用提供理论依据。 方法： 成年雄性SD大鼠60只，体重为230g～280g，随机分为假手术组(S组，n=15)、缺血再灌注组(I/R组，n=15)、乌司他丁组(U组，n=15)和乌司他丁+LY294002组（U+LY组，n=15）。采用线栓法行大鼠右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）制备局灶性脑缺血再灌注模型，缺血2h再灌注。S组大鼠只做手术处理，但不行缺血处理；I/R组大鼠行脑缺血后2h再灌注24h；U组大鼠在缺血再灌注即刻行尾静脉注射乌司他丁10万U/kg；U+LY组大鼠在行脑缺血再灌注造模前15min，先行侧脑室注射LY294002，乌司他丁预处理方法同U组。S组和I/R组于再灌注后注射等容量生理盐水。在缺血再灌注后24h，观察大鼠行为学改变，进行神经功能缺陷评分（NDS）。在脑缺血再灌注24h，取脑组织切片后行TTC染色，图像分析计算脑梗死体积；用ELISA法检测大鼠血浆8-OHdG的含量；采用免疫印迹试验测定缺血侧脑皮质p-Akt、Akt表达。 结果： 1．大鼠的神经功能缺陷评分 S组未见神经功能缺陷。在缺血再灌注24h，I/R组、U组及U+LY组大鼠均出现对侧前肢不能伸直，行走时向左侧旋转或倾倒等行为学改变，神经功能缺陷（NDS）评分均高于S组(P<0.05)；与I/R组比较，U+LY组、U组的NDS评分明显低于I/R组(P<0.05)；与U+LY组比较，U组NDS评分低于U+LY组(P<0.05)。 2．大鼠脑梗死体积的测定 S组未见脑梗死灶,TTC被线粒体过氧化氢酶还原，诱发产生深红色产物而使正常组织染成红色。在缺血再灌注24h，其余各组均可见不同程度的脑梗死灶，与 I/R组比较，U+LY组、U组的脑梗死体积均小于 I/R组(P<0.05)；与U+LY组比较，U组脑梗死体积低于U+LY组(P<0.05)。 3．大鼠血浆8-OHdG含量变化各组均可测到血浆8-OHdG含量。与S组比较，在缺血再灌注24h，U组血浆8-OHdG含量有升高但差异无统计学意义(P＞0.05)，而I/R组、U+LY组的血浆8-OHdG含量即明显高于S组(P<0.05)。与I/R组比较，U+LY组、U组在缺血再灌注24h的血浆8-OHdG含量均低于I/R组(P<0.05)。与U+LY组比较，U组在缺血再灌注24h的血浆8-OHdG含量又低于U+LY组(P<0.05)。 4．大鼠缺血侧脑皮质的Akt、p-Akt表达 S组和各缺血组的缺血侧脑皮质均有Akt和p-Akt表达。在缺血再灌注24h，与S组比较，I/R组、U组和U+LY组的Akt表达无明显变化(P＞0.05)。在缺血再灌注24h，I/R组p-Akt表达较S组有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)；但U组、U+LY组的p-Akt表达较S组升高(P＜0.05)，而且又以U组明显(P＜0.05)。与I/R组比较，U组、U+LY组的p-Akt表达均升高(P＜0.05)，同样以U组明显(P＜0.05)。 结论： 1．在脑缺血后再灌注前给予乌司他丁10万u/kg静脉注射，能降低脑缺血再灌注后24h大鼠的神经功能缺陷评分，减少脑梗死体积。 2．在脑缺血后再灌注前给予乌司他丁10万u/kg静脉注射，能上调脑皮质p-Akt的表达，降低8-OHdG的含量，提示乌司他丁减轻脑缺血再灌注损伤与激活PI3K-Akt信号通路及抗氧化应激作用有关。