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新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)强毒株引起的一种极具传染性的烈性传染病，被国际兽疫局(OIE)列为法定报告疾病之一。NDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)，禽腮腺炎病毒属(Avuluvirus)中的成员，是单股、负链、不分节段、有囊膜的RNA病毒。本研究对一株NDV经典弱毒疫苗株La Sota进行了连续5轮的鸡胚有限稀释纯化，筛选到一株血凝价高，致病力低的纯化培养克隆株C5；重新测定了其全基因组序列后，还在此基础上，成功构建了La Sota C5株的全长cDNA克隆和三个辅助质粒。经转染BSR/T7-5细胞后，拯救出了带有遗传标记的重组病毒。同时，本研究还制备了抗鸡β干扰素(Interferon-β)的单克隆抗体，为日后更好地研究NDV在感染时与鸡先天性免疫系统之间的关系奠定了基础。1.疫苗株La Sota的纯化及全基因组序列分析La Sota是目前国内使用最广泛的弱毒疫苗株。但由于年代久远，国内保存的La Sota经过反复传代后，出现了鸡胚半数感染量和血凝价下降的现象。为了提高La Sota疫苗株的生产性能，本研究通过鸡胚有限稀释法对本实验室保存的一株La Sota进行了鸡胚有限稀释纯化。每个代次取稀释度最大且血凝价较高的La Sota尿囊液作为传代接种物，继续传代，纯化五个代次后获得一株高血凝价的纯培养克隆株La Sota C5。参照GenBank上公布的La Sota的全基因组序列，设计12对引物。经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从La Sota C5株感染的鸡胚尿囊液中扩增目的片段，并分别克隆至pGEM-T Easy载体，每个片段至少挑取五个阳性克隆送样测序。将获取的各个片段序列用DNAstar软件进行拼接和分析。与GenBank上已公布的La Sota全基因组序列存在52个碱基的差异。2.新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的建立参照La Sota C5株的全基因序列，将基因组分成8段，经RT-PCR从La Sota C5株感染的尿囊液中扩增得到目的片段，分别连入克隆载体中。首先将基因组3’和5’端序列，连入转录载体TVT(0.0)中，得到TVT-LT；然后其它片段依次克隆到pMD-20T载体中，构建了含有La Sota C5基因组大部分片段的中间质粒RLBESAB。该质粒和TVT-LT经BglⅡ酶切后各自回收大带，最后连接为含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-La Sota C5。同时构建了含La Sota C5株NP、P和L基因的三个辅助质粒PCI-NP、PCI-P和PCI-L。将三个辅助质粒与全长转录载体共转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞。转染72h后，将细胞反复冻融三次后接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。收集24h后死亡鸡胚尿囊液。按OIE标准测其血凝(HA)效价，并用RT-PCR方法和基因测序鉴定是否为拯救病毒。结果显示第一代尿囊液HA效价为28，传代三次后，HA滴度上升为211。序列测定表明拯救病毒带有引入的遗传标记，证明成功拯救出了具有感染性的La SotaC5株新城疫病毒。La Sota C5株反向遗传操作平台的建立为后续研究新城疫弱毒各结构基因的功能和开发新型新城疫病毒疫苗等的研究奠定了基础。3.抗鸡β干扰素单克隆抗体的制备及初步鉴定参照GenBank上鸡β干扰素的序列（登录号：GU119897），设计一对引物，从鸡肝脏中扩增出β干扰素基因。将其连入原核表达载体pCold TF DNA中，构建成原核表达质粒pCold-ChIFN-β。将鉴定正确的阳性质粒转化入BL21感受态细胞，阳性菌液经0.5mmoL/L IPTG，15℃低温诱导24h。重组蛋白参照上海悦克生物科技有限公司镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）操作说明进行纯化。纯化后的蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠，四免后进行细胞融合，采用杂交瘤技术筛选单克隆。共筛选出两株单克隆株。大量培养后，制备腹水。经ELISA鉴定，两株单抗的腹水效价均达到10-3以上；Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与表达的鸡IFN-β发生特异性反应；其中一株单抗可检测浓度小于125pg/mL的鸡IFN-β。本研究为检测鸡IFN-β提供了一种重要工具，也为鸡β干扰素检测ELISA试剂盒的制备及评价鸡用疫苗的免疫效果等奠定了基础。