论文部分内容阅读
[目 的]人类在百草枯（PQ）中毒后会出现致死性的肺组织毒性。PQ被吸收入血液后,肺组织细胞膜上的多胺转运体会对PQ进行主动摄取,造成PQ富集在肺组织细胞内。PQ依赖于线粒体内膜电位差（Δ Ψm）进入线粒体基质,在复合体Ⅰ与NADH反应生成氧自由基,进而引起线粒体基质过氧化损伤,并破坏线粒体内的遗传物质。氧自由基也会引起脂质过氧化,破坏线粒体膜、细胞器以及细胞内的遗传物质。氧自由基进一步会引起上皮细胞间质转化的保护性修复,发生肺纤维化,最终导致患者呼吸衰竭死亡。针对这一现象,至今尚无有效的治疗方法。然而值得注意的是有文献报道获得性免疫缺陷病毒（HIV）感染的患者在PQ中毒后没有出现肺纤维化病变。HIV病毒感染人类后通常会破坏人类的CD4+T淋巴细胞,并表现为以CD4+T淋巴细胞缺失为主要症状的免疫缺陷综合征（AIDS）。有研究表明CD4+T淋巴细胞可能参与了肺纤维化的发生与发展,但是目前缺乏T淋巴细胞在PQ中毒所致肺纤维化过程中所起作用的研究。我们选择了遗传性T淋巴细胞免疫缺陷的裸鼠BALB/C（nu/nu）作为实验动物模型,通过对比裸鼠BALB/C（nu/nu）与小鼠BALB/C（nu/+）PQ灌胃后的肺纤维化程度来验证T淋巴细胞免疫缺陷在PQ中毒所致肺纤维化中所起的作用。[方 法]（1）使用裸鼠BALB/C（nu/nu）建立T淋巴细胞免疫缺陷的PQ中毒实验动物模型,对照小鼠BALB/C（nu/+）进行PQ中毒建模试验。首先用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测两个品系的小鼠中毒1h后的血浆中PQ的浓度,通过不同剂量灌胃来获取PQ对两个品系小鼠的半数致死量等毒理学数据。（2）进行T淋巴细胞的移植,取同母系小鼠BALB/C（nu/+）分离脾脏和血液中的淋巴细胞,培养增殖后通过尾静脉注射移植到裸鼠BALB/C（nu/nu）体内。取同母系两周龄小鼠BALB/C（nu/+）的胸腺组织块,用套筒针种植到裸鼠BALB/C（nu/nu）竖脊肌肌膜下,然后将小鼠的脾脏组织过尼龙网后通过腹腔注射到裸鼠BALB/C（nu/nu）体内。通过上述细胞移植的方法在裸鼠BALB/C（nu/nu）体内重建T淋巴细胞免疫系统。（3）用流式细胞仪检测各组小鼠体内的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞数量,通过检测两个品系小鼠PQ中毒1周后肺泡灌洗液中的细胞数目来判断T淋巴细胞免疫缺陷在PQ所致急性肺泡炎症中的作用。（4）用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法检测小鼠血清中白细胞介素4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（INF-γ）的水平以及肺组织中羟脯氨酸（HYP）、转化生长因子β 1（TGF-β 1）的水平。（5）用免疫组化染色检测肺组织中的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原 Ⅰ（collagenⅠ）、胶原 Ⅲ（collagen Ⅲ）、波形蛋白（vimentin）和E-钙粘蛋白（E-cadherin）的水平。（6）用免疫印迹 Western-Blotting（WB）检测 TGF-β 1信号通路中的:P-Smad2、P-Smad3、Smad2/Smad3和α-SMA的相对表达水平。[结 果]（1）GC-MS检测显示,20mg/kg剂量的PQ灌胃1小时后两个品系小鼠的血浆中PQ的浓度差异无统计学意义。（2）PQ对裸鼠BALB/C（nu/nu）以及小鼠BALB/C（nu/+）的半数致死量没有差异。（3）20mg/kg剂量的PQ单次灌胃可以诱导裸鼠BALB/C（nu/nu）和小鼠BALB/C（nu/+）发生肺纤维化,并能显著影响其体重,肺重以及肺系数。（4）流式细胞仪检测显示,裸鼠组、小鼠BALB/C（nu/+）组与裸鼠BALB/C（nu/nu）+T淋巴细胞移植组的T淋巴细胞的数量存在差异且有统计学意义,表明T淋巴细胞移植成功。（5）20mg/kg PQ中毒的裸鼠BALB/C（nu/nu）组在第7天的炎症反应比小鼠BALB/C（nu/+）组严重,两个组的肺泡灌洗液细胞数量存在统计学差异。（6）裸鼠BALB/C（nu/nu）组在PQ中毒后血液中IL-4,TNF-α,IFN-γ等因子的表达量低于小鼠BALB/C（nu/+）组,小鼠BALB/C（nu/+）组和裸鼠BALB/C（nu/nu）给与T淋巴细胞移植组的肺组织中TGF-β 1和HYP的表达量高于裸鼠BALB/C（nu/nu）组。（7）小鼠BALB/C（nu/+）+PQ组的α-SMA、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ免疫组化染色切片的阳性染色指数比裸鼠BALB/C（nu/nu）+PQ组的高出2-3倍左右。（8）裸鼠BALB/C（nu/nu）在PQ中毒后在缺乏T淋巴细胞的情况下,TGF-β 1-smad2/3信号通路的因子表达量降低,α-SMA的表达量减少。[结 论]（1）T淋巴细胞免疫缺陷能减轻实验动物PQ中毒诱导的肺纤维化。（2）裸鼠BALB/C（nu/nu）在PQ中毒后有肺纤维化发生,T淋巴细胞免疫缺陷不能完全避免肺纤维化的发生。