食管癌（Esophageal cancer，EC）是最常见的六大恶性肿瘤之一，河南林州地区是世界上食管癌发病率最高的地区，组织类型以食管鳞癌（Esophagealsquamous cell carcinoma，SCC）为主（95％）。该地区贲门腺癌（Gastric cardiaadenocarcinoma，GCA）发病率也很高。目前，SCC和GCA仍然是该地区肿瘤相关主要死亡原因。该地区的另一特殊现象是同一个体同时发生食管鳞癌和贲门腺癌，我们称之为食管／贲门双源癌（Primary concurrent cancers of the esophagusand gastric cardia from the same patient，CC）。食管／贲门双源癌并不少见，但由于食管／贲门双源癌漏诊率很高（90％），其发生率的报道差异很大（0.4-2.5％）。我们实验室对林州地区14805例单发食管癌和贲门癌患者进行回顾调查，发现双源癌占本组病例的7％。发生于同一个体的食管／贲门双源癌处于相同的机体内环境，接触相同的外界环境因素，遗传背景相似，因此，对比分析食管／贲门双源癌组织分子变化特征，不仅有助于加深对食管鳞癌和贲门腺癌分子差异的认识，对阐明食管／贲门癌变机理，进一步筛选和鉴定用于高危人群预警和早期发现的分子指标和手段提供重要的理论依据和信息。但是，因食管／贲门双源癌漏诊率高，资料收集比较困难，目前国内外有关食管／贲门双源癌的研究报道甚少，多数资料为临床个案报道，有关分子机理的研究报道更少。本实验室检测河南林州地区食管／贲门双源癌组织中11种蛋白表达（P53，Rb，P16，mdm2，C-erb2，bax，MUC1，PCNA，CyclinDl，bcl-2，P21waf1），发现MUC1，bcl-2和P53在食管癌和贲门癌组织中一致性表达率最高。然而，单纯分析这些蛋白质变化特征，很难全面反映食管／贲门双源癌组织细胞内全部蛋白质的表达状况，从而难以确定食管／贲门双源癌癌变关键蛋白。近年研究提示，蛋白质组研究是检测细胞恶变相关差异表达蛋白，阐明癌变机理的有效手段之一，特别是表面增强激光解析离子化-飞行时间-质谱（surfaceenhanced laser desorption inionation-time of flight-mass spectra，SELDI-TOF-MS）蛋白质组学技术，具有高通量和高灵敏度等特点，特别适合肿瘤标志物的筛查研究。但是，由于SELDI-TOF-MS技术主要检测患者血清差异蛋白，这些差异蛋白不能完全反映肿瘤组织中蛋白和基因的改变，而肿瘤组织比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）是一种将原位荧光杂交技术与数字图像分析相结合，检测肿瘤组织DNA全基因组异常（缺失、扩增、复制），并在染色体上定位这些变化的基因。很显然，在分析患者血清蛋白质组变化的基础上，结合组织CGH分析，将能更全面了解食管／贲门双源癌患者特异蛋白和基因改变，因此本研究采用SELDI-TOF-MS技术与CGH技术，从蛋白和基因水平探讨食管／贲门双源癌的血清和组织分子变化特征和规律，并与单发食管癌和单发贲门癌分子改变进行比较，筛选和确定食管／贲门双源癌相关侯选蛋白和基因，加深对其癌变分子机制的了解，并为进一步筛选和建立用于高危人群预警和早期发现的分子指标和手段提供重要的理论基础和信息。2．材料与方法2．1研究对象食管／贲门双源癌患者（双源癌组）：共19例，来自河南省林州市食管癌医院及林州市中心医院（男15例，平均年龄62±11岁；女4例，平均年龄71±11岁）。病理检查证实为原发食管鳞癌和贲门腺癌。单发食管癌患者（食管癌组）：共61例，来自河南省林州市食管癌医院及林州市中心医院（男36例，平均年龄59±79岁；女25例，平均年龄56±9岁）。病理检查证实均为食管鳞癌，T分期：T1：7例，T2：8例，T3：44例，T4：2例；合并淋巴结转移25例。单发贲门癌患者（贲门癌组）：共47例，来自河南省林州市食管癌医院及林州市中心医院（男36例，平均年龄61±8岁；女11例，平均年龄61±10岁）。病理检查证实为贲门腺癌，合并淋巴结转移23例。健康对照组：共50例，来自食管癌高发区无症状普查居民（男29例，平均年龄56±11岁；女21例，平均年龄60±10岁）。均经胃镜检查和活检病理证实为无食管炎等食管良性疾病。2．2样本（血清、组织）的收集2．2．1血清：所有检测对象均取5ml空腹静脉血，将血清与血凝块分装，-80℃冰箱保存。特别指出，取血样前，每例检查对象均排除急慢性炎症（肝炎，等）等疾病。2．2．2组织：各种手术切除标本均一分为二，一半固定，一半冰冻（-80℃），常规组织学处理，病理观察，备用。2．3方法2．3．1 SELDI-TOF-MS和IMAC-Cu蛋白芯片检测血清蛋白质组。2．3．1．1样品的准备取10μl血清样品，加20μl U9（9M尿素，2％CHAPS，50mM Tris-HCL调到pH9.0）缓冲液，4℃振荡30min，使蛋白变性。取上清液10μL加120μL结合缓冲液（50mM NaAC，PH3.5）震荡混匀5分钟备用。2．3．1．2芯片的预处理IMAC-Cu芯片每孔依次加入50μl 100mmol／L硫酸铜，50μl 100mmol／L醋酸钠（pH4.0），150μl结合／洗脱缓冲液（50mmol／LHEPES，pH7.0），最后每孔加入50μl稀释好的样品，4℃孵育60min后除去缓冲液，缓冲液冲洗。取出芯片风干，备检。2．3．1．3芯片检测利用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪和IMAC-Cu芯片进行检测，检测的蛋白质的分子量区间为1500-20000Da，低于1500Da的蛋白质或肽段将自动从波谱中被清除。采用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，设定仪器参数，在CipherGen ProteinChip软件中设定读片程序读取芯片数据，由计算机根据所获得的原始数据快速精确地绘制出蛋白质质谱图，其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。2．3．2候选相关蛋白质检索：根据差异蛋白质的质核比（相对分子质量），在SWISS-PROT蛋白数据库中通过http://us.expasy.org/tools/tagident.html网站检索与其相匹配蛋白质，分子量允许的误差范围＜0.5％。2．3．3 CGH技术：2．3．3．1组织微切除对肿瘤组织进行冰冻切片。95％的乙醇固定，苏木精轻染，解剖显微镜刮片，5号针头刮取把肿瘤组织和周围的间质及正常细胞分开，刮下的肿瘤细胞转入1.0ml的离心管中。应用蛋白酶K／SDS消化刮取的肿瘤细胞，酚／氯仿／异丙醇抽提DNA。正常参照组DNA来自人正常胎盘组织。2．3．3．2正常人外周血细胞有丝分裂中期染色体标本的制备常规外周血淋巴细胞培养。抽取健康男性静脉血5ml，每1ml加入10mlRPMI-1640培养基（20％FBS），植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）120μl（48μg）进行外周血培养（5％CO₂培养孵育72h），培养终止前30min加入秋水仙素50μl（0.5μg），用0.075mol／L KCl低渗液处理20min，使细胞分裂停留在中期，甲醇-冰醋酸（3：1）固定，制成细胞悬液，滴片，自然干燥，37℃孵育3-7天备用。2．3．3．3 DNA探针的制备切口平移法标记DNA探针。1μg肿瘤组织DNA和1μg正常参照组DNA分别用Spectrum-Green-dUTP（Vysis，Downers Grove）和Spectrum-Red-dUTP（Vysis，Downers Grove）标记。15℃反应2h，凝胶电泳核对DNA片段为200-2000 bp，以产生均匀一致、强烈的杂交信号。标记好的DNA探针用乙醇沉淀纯化。2．3．3．4比较基因组杂交标记好的肿瘤基因组DNA探针和正常参照组探针和Cot-1DNA溶于10μl杂交缓冲液中（体积分别为50％甲胺，2^*SSC，pH7.0）75℃变性5min。制备好的中期分裂相玻片，RNase处理，70％甲酰胺变性液75℃，变性5min，2×SCC各5min。杂交混合液滴于玻片上，湿盒内37℃孵育3天。杂交后玻片用0.4×SCC／0.3％NP40洗液75℃洗片2min，然后用2×SCC／0.1％NP40室温下洗片2min，洗片后用1μg／ml的DAPI 40μl进行染色。2．3．3．5 CGH图象分析应用装有Sensys相机的Zeiss Axioplan 2显微镜对杂交的中期染色体进行数字化图象处理，Quips CGH程序（Vysis，Downers Grove，IL）进行图象分析，每一例至少应用5个中期相细胞产生的荧光比率进行综合分析。DNA序列拷贝数增加和丢失的分析阈值分别为肿瘤／正常参照比率＞1.25或＜0.75，高拷贝数的扩增为肿瘤／正常参照比率＞1.50。2．3．4 RT-PCR技术RNA提取使用Promega公司SV Total RNA Isolation System试剂盒提取，方法按手册建议进行。反转录使用Promega公司ImProm-Ⅱ^TM Reverse TranscriptionSystem试剂盒，方法按手册建议进行。PCR引物由上海生物工程公司合成COX7Cforward：5’-CCA GAG TAT CCG GAG GTT CA-3’，reverse：5’-GAAAGG TGCGGCAAACC-3’，扩增片段为151bp；Beta-defensin1-2-3 forward：5’-TGATGCCTC TTC CAG GTG TT-3’，reverse：5’-GAT GAG GGA GCC CTT TCT GA-3’，扩增片段为205bp。5U／μl Taq DNA Polymerase，10^*Buffer，25mM MgCl₂购自MBI Fermentas公司，10mMdNTP购自宝生物工程（大连）有限公司，体系为10×Reaction buffer 2μl，10mmoI／L dNTPs 2μl，25mmol／L MgCl₂ 1.6μl，forwardprimer 0.8μl，reverse primer 0.8μl，Taq DNA Polymerase 0.1μl，Template DNA2μl，Sterile deionized Water 10.7μl。共20μl。反应条件分别为：COX7C 95℃预变性3min，94℃变性30s，40℃退火2min，72℃延伸45s，共40个循环，72℃延伸5min。Beta-defensinl-2-3 94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸8min。产物经1％的普通琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过凝胶成象系统分析电泳结果。2．3．5数据处理与统计学分析所有蛋白质组检测数据先用Proteinchip Software 3.1进行统一校正，使总离子强度及分子量达到均一化。再用Biomarker Wizard软件方差分析，计算不同组相同质荷比的蛋白质含量的P值，通过P值可以比较每个获得的蛋白质峰在各组间蛋白质表达的差异性的显著程度。P＜0.05被认为差异具有显著性。各组间蛋白表达差异等数据采用SPSS10.0统计软件处理，采用χ²检验和Kappa检验等统计学方法对资料进行统计学分析，取a=0.05。3．结果3．1 SELDI-TOF-MS检测血清标本3．1．1双源癌组与对照组质谱对比分析两者间有10种显著性差异的蛋白，以M2866.21Da、M5103.30Da、M6597.65Da、M7931.55Da、M9311.96Da、M4113.99Da等6种蛋白质建立决策树诊断模型可将双源癌患者与健康对照组正确分组的准确率、敏感度和特异度分别为78.26％、73.68％和80％。3．1．2双源癌组、单发食管癌组、单发贲门癌组与对照组质谱对比分析共有22种显著性差异的蛋白质（P＜0.05），其中50％（11／22）在双源癌、单发食管癌和单发贲门癌三组中呈一致性改变，63％（14／22）在双源癌和单发贲门癌组血清蛋白质呈一致性改变，86％（19／22）在单发食管癌与单发贲门癌呈一致性改变。3．1．3双源癌、单发食管癌和单发贲门癌组成的肿瘤混合组与对照组质谱对比分析有16种显著性差异蛋白，以M／Z值为M3154.10Da、M5077.56Da、M5340.52Da、M5849.26Da、M5869.54Da、M5897.23Da、M5950.50Da、M7770.81Da、M8157.72Da、M1519.88Da、M2889.83Da、M13872.6Da和M1486.54Da等13种蛋白质建立的决策树对肿瘤混合组诊断的准确率、敏感度和特异度分别为：80.23％、83.54％和72％。3．1．4双源癌、单发食管癌和单发贲门癌三组之间质谱相互对比分析双源癌与单发食管癌有20种显著性差异的蛋白，双源癌与单发贲门癌之间有17种显著性差异的蛋白，单发食管癌和单发贲门癌之间有9种显著性差异的蛋白。3．1．5单发食管癌组与对照组质谱对比分析两者之间存在有18种显著性差异的蛋白，以M9439.58Da、M6627.21Da、M2867.65Da、M4494.08Da、M7762.68Da、M6835.32Da和M4095.94Da等7种蛋白质建立决策树诊断模型将单发食管癌与健康对照组正确分组的准确率、敏感度和特异度分别为85.6％、88.5％和82％。3．1．6单发食管癌T分期蛋白质谱对比T1组和T2组：未发现显著性差异蛋白；T1组和T3组：检测到2种（M4297.26Da、M4241.78Da）具有显著性差异蛋白，均为单发食管癌的下调蛋白，相对含量比较为：T3组＞T1组（P＜0.05）；T2和T3组：检测到2种（M6679.04Da、M6801.31Da）具有显著性差异蛋白，均为单发食管癌的下调蛋白，相对含量为：T3组＞T2组（P＜0.05）。3．1．7单发食管癌淋巴结转移组与未转移组质谱对比分析检测到2种（11730.18Da、9295.28Da）具有显著性差异的蛋白质，均为单发食管癌的下调蛋白，相对含量为：未转移组＞转移组（P＜0.05）。3．1．8单发贲门癌与对照组质谱对比分析两者之间存在有20种显著性差异蛋白，12种蛋白明显上调，8种蛋白明显下调，以M／Z为M5908.48、M7943.64和M8938.70等3种蛋白质建立决策树诊断模型，可将健康人与单发贲门癌患者正确分组的准确率、敏感度和特异度分别为77.3％、85.1％和70％。3．1．9单发贲门癌中分化组与低分化组质谱对比分析两者之间存在15种显著性差异蛋白，12种为单发贲门癌上调蛋白，相对含量：低分化组＞中分化组（P＜0.05）；3种为单发贲门癌下调组蛋白，相对含量为：低分化组＞中分化组（P＜0.05）。3．1．10双源癌、单发食管癌、单发贲门癌三组差异蛋白质的关系双源癌、单发食管癌和单发贲门癌与对照组相比分别有10种、18种和20种显著性差异的蛋白质（M／Z）。其中6种为3组共同的差异性蛋白；双源癌与单发食管癌之间有7种共同的差异性蛋白；双源癌与单发贲门癌之间有7种共同的差异性蛋白，单发食管癌与单发贲门癌之间有9种共同的差异性蛋白。3．2 SWISS-PROT蛋白质数据库检索和候选蛋白mRNA表达3．2．1利用SWISS-PROT蛋白质库筛选候选蛋白对检测出的10种具有显著性差异的蛋白（M／Z），根据其分子量从SWISS-PROT蛋白质数据库中查询到与它们相匹配的蛋白质80种，依据双源癌中差异蛋白的相对含量（下调蛋白或上调的蛋白），从中筛选出21种与肿瘤相关的蛋白质（Cytochrome c oxidase subunit 7C，COX7C；Beta-defensin1-2-3，BDF123等），文献中均未见有关这些蛋白与双源癌关系研究的报道。3．2．2侯选相关蛋白在双源癌组织中mRNA的表达依据统计学差异分析及与肿瘤相关性，从21种双源癌候选相关蛋白中，筛选出二种密切相关蛋白（COX7C和Beta-defensin1-2-3），进一步检测其在双源癌组织中的表达特征。RT-PCR结果显示：双源癌组织COX7C mRNA表达阳性率为60％：双源癌标本中的食管癌组织和贲门癌组织阳性表达率相同。对照组正常食管上皮组织和贲门上皮组织均为阴性表达。双源癌组织中，食管癌Beta-Defensin1-2-3 mRNA阳性率（60％）高于同一个体贲门癌组织（40％）。对照组正常食管上皮组织和贲门组织COX7C和Beta-defensin1-2-3均为阴性。3．3双源癌组织CGH分析双源癌患者SCC与GCA相比，DNA拷贝数频发增加的染色体部位相似，主要为6p和13q；但是二者在DNA拷贝数频发丢失的染色体部位不尽相同，SCC频发丢失的染色体部位是8p，17p，18q，而GCA以1p，16q，17p和21q为主。3．4双源癌患者血清和组织蛋白质谱和CGH结果比较蛋白质谱筛选与双源癌密切相关的21种候选蛋白中，17种与CGH发现的频发DNA拷贝数频发增加和丢失的基因位点相吻合（81％，17／21）；其中8种上调或下调的蛋白质与CGH检测的DNA拷贝数频发增加或丢失相吻合，但是，4种蛋白表达上调或下调时，与CGH检测的DNA拷贝数频发增加或丢失正相反；另外5种蛋白表达上调时CGH检测的DNA拷贝数既有增加又有丢失。4．结论4．1双源癌、单发食管癌、单发贲门癌分别与对照组蛋白质组对比发现有6种候选蛋白在3种肿瘤中同时存在，占双源癌候选蛋白的60％（6／10），明显高于单发食管癌（33％）和单发贲门癌（30％）所占的比例。提示该6种蛋白为双源癌的重要候选蛋白；同时提示该地区双源癌、单发食管癌和单发贲门癌患者之间存在相似的分子基础。4．2 CGH检测显示双源癌组织中，食管鳞癌基因组DNA拷贝数异常的频发部位分别是6p（75％），13q（50％）（扩增）和8p（50％），17p（50％）（丢失），与同一个体贲门癌基因组DNA拷贝数异常的频发部位相一致的分别是13q（50％），6p（50％）（扩增）和17p（50％）（丢失），进一步提示双源癌患者食管癌和贲门癌具有相似的分子基础。4．3 SELDI-TOF-MS和CGH分别检测的候选蛋白和候选基因的吻合率为81％，提示这两种技术有较高的重复性和特异性，所发现的候选蛋白和基因可能是食管／贲门双源癌癌变的重要分子基础。4．4通过对单发食管癌和单发贲门癌不同病理分期的蛋白质组分析，发现4种与单发食管癌不同T分期密切相关的蛋白质；其中11730.18Da、9295.28Da等2种蛋白质与单发食管癌淋巴结转移和贲门癌的分化程度密切相关，提示该组蛋白是单发食管癌和贲门癌预后的重要分子基础。4．5 COX7C和Beta-defensinl-2-3在正常组织中mRNA均为阴性，在双源癌组织中高表达，与血清蛋白质高表达一致。提示利用SELDI-TOF-MS检测出的侯选蛋白参与了食管／贲门双源癌的发生，为筛选肿瘤标志物提供了重要的技术平台。