木麻黄(Casuarina equisetifolia L.)是海南省重要的海防林树种,但随着林龄的增长,木麻黄林出现自我更新困难的问题,其主要原因是化感物质的积累。我们前期的研究表明,引起木麻黄化感作用的物质除自身次生代谢合成和土壤微生物合成外,木麻黄植株内生真菌也是化感物质的来源。因此,本文运用高通量测序平台,分析不同林龄木麻黄根内生细菌群落结构的多样性;利用传统的分离方法分离纯化不同林龄根内生细菌并用16s DNA进行菌种鉴定;用分离鉴定出的不同内生细菌发酵液对木麻黄种子进行处理,以探究不同内生细菌发酵液对木麻黄种子萌发的化感潜力;此外,挑选3种对木麻黄种子萌发化感潜力最强的内生细菌,利用气质联用(GC-MS)技术对其发酵液的甲醇和正己烷萃取液进行鉴定,并与前期相应林龄的木麻黄根、土壤水浸提液的甲醇和正己烷萃取液鉴定出的物质成分进行比较。其研究结果不仅可以阐明木麻黄植株内生细菌参与化感作用的理论基础,也可为后续采用工程菌株或微生物制剂进行木麻黄林的更新和改造提供实践指导。本文研究结果如下:1.通过高通量测序对幼、中、成龄林木麻黄根基因组DNA进行16S rDNA定向测序,共得到330447条平均长度约为430-448bp的序列。不同林龄木麻黄根内生细菌物种组成丰富,中龄林根内生细菌的多样性最高,成熟林次之,幼龄林最低。此外,3个林龄内生细菌在群落结构上有一定的差异,其中幼龄林和成熟林根内生细菌的群落组成较相似,与中龄林存在差异。幼龄林和成熟林均主要以变形菌门假单胞菌科的假单胞菌属、厚壁菌门芽孢杆菌科的芽孢杆菌属和厚壁菌门肠球菌科的肠球菌属为主;而中龄林中占主导地位的为变形菌门黄单胞菌科的黄单胞菌属以及放线菌门嗜酸栖热菌科的嗜酸栖热菌属。土壤的理化性质如有机质、硝态氮和铵态氮对不同林龄木麻黄根内生细菌的组成有显著影响。说明木麻黄根内生细菌群落结构的多样性受林龄、环境因子等因素的影响。2.采用传统的分离方法从3个林龄木麻黄根中分离内生细菌,对分离得到的内生细菌进行形态观察并结合16S rDNA序列测定及同源性分析。结果表明,分离得到的36株内生细菌属于9属21种,其中芽孢杆菌属(Bacillus)6种,占总菌种数的28.57%,为优势种;不动杆菌属(Acinetobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)各3种,各占总菌种数的14.29%,为次优势种。此外,幼龄林5属8种,占总菌种数的38.10%;中龄林6属10种,占总菌种数的47.62%;成熟林6属11种,占总菌种数的52.38%。3.不同木麻黄根内生细菌发酵液对木麻黄种子的萌发均有不同程度的抑制作用,并降低了种子的发芽率。其中,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵液对种子萌发的抑制作用最强,化感效应指数为-1;其次是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai),化感效应指数为-0.99;而蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)发酵液的抑制作用最弱,化感效应指数为-0.008。4.通过GC-MS技术在不同木麻黄根内生细菌的次生代谢产物中检测出酚、酮、酯、有机酸、醇类等有机化合物,其中2,2’-亚甲基双-[4-甲基-6-叔丁基]苯酚和1,2,3,4-丁四醇2种化合物为内生细菌代谢产物与根、土壤浸提液所共有;而4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸、3,4,5-三羟基苯甲酸、对苯二胺、3-氨基苯酚和3,5-二甲氧基苯酚5种化合物为内生细菌代谢产物所特有。以上结果表明,木麻黄根内生细菌的多样性是随着林龄发生变化的,且与有机质、硝态氮和铵态氮等环境因子密切相关。此外,可培养内生细菌的次生代谢产物可对木麻黄种子产生化感作用,表明木麻黄内生细菌可通过直接产生次生代谢产物参与木麻黄化感物质的合成,也有可能是内生细菌通过与木麻黄植株进行遗传信息的传递或基因交换等互作调控参与化感物质的合成。