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丹参(Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物,具有较高的药用价值,据《神农本草经》中记载丹参干燥的根和茎可入药。丹参在东亚各国广泛种植用于治疗和预防心脑血管疾病、高血脂和急性缺血性中风,其活性成分包括水溶性和脂溶性两种。丹参在临床上应用广泛使得需求量日益增加,人们开始寻找新的途径解决资源短缺。如今,通过次生代谢途径上关键酶基因克隆和遗传转化研究,提高次生代谢产物的产量逐渐成为药用植物生物技术的研究热点,而建立高效的遗传转化体系是基因工程研究的前提。农杆菌转化法作为丹参主要的遗传转化方法,其条件逐渐被优化。由于丹参毛状根易培养、生长周期短等优越性,毛状根遗传转化体系的优化比较完善,而丹参植株遗传转化体系优化方面的研究较少。本研究通过筛选农杆菌转化过程中影响转化效率的因素,最终建立起高效可靠的丹参植株遗传转化体系,为进一步利用基因工程技术改良丹参品质奠定了基础。1.丹参遗传转化体系的构建以丹参叶片作为外植体,通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将携带gus基因的pCAMBIA2301转入丹参外植体中,初步建立起丹参的高效遗传转化体系。通过gus基因瞬时表达检测,探究农杆菌菌株类型、共培养时间、不同类型抗生素及浓度对丹参转化率的影响。结果表明,以上因素都是农杆菌介导丹参遗传转化的重要影响因子。优化后的转化方法是：将组培苗叶片剪成0.5cm2,于1/2MS重悬液制备的ODλ600=0.6菌液中浸泡30mmin,用无菌滤纸吸干菌液并接种于含1mg/L6-BA0.5mg/L2,4-D的MS共培养基上进行3d共培养。共培养后的外植体用无菌水冲洗5遍,无菌滤纸吸干水后转接到含1mg/L6-BA、0.5mg/L2,4-D、400mg/L特美汀的MS除菌培养基上,除菌培养诱导愈伤组织和幼芽阶段需添加50mg/L卡那霉素进行阳性筛选。筛选出的幼芽接种到含0.2mg/L IBA的1/2MS生根培养基上,诱导生根和促进植株生长。2.丹参过表达SmGGPPS和SmKSL的转基因研究根据SmGGPPS和SmKSL的序列信息设计两端引物,从丹参基因组中扩增目的片段,连接至pMD19-T载体上。用XbaI/SacI对SmGGPPS进行双酶切,用BamHI/SacI对SmKSL进行双酶切,插入pCAMBIA2301植物表达载体,最终经过酶切检测和测序检测确定目的片段整合到载体上。将含有目的基因的载体通过本研究构建的农杆菌介导转化法导入植物体中,经过筛选和PCR检测获得转基因幼苗,炼苗后移栽于盆中,经过一段时间的培养,对过表达SmGGPPS和SmKSL进行初步的转基因研究。