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目的:观察2型糖尿病(T2DM)大鼠成模过程中血浆内毒素水平与胰岛素抵抗的关系;观察盐酸小檗碱干预T2DM大鼠的疗效,及其对宿主肠道菌群结构和血浆内毒素水平的影响,探讨盐酸小檗碱治疗T2DM大鼠的作用机制。方法:选择健康的雄性SD大鼠66只,出生年龄均为6-8周,体重180g-200g,随机分为两组:正常对照组(简称NC组,n=24)和T2DM组(简称T2DM组,n=42)。NC组大鼠普通饲料喂养。T2DM组大鼠经高糖高脂膳食喂养12周后,隔夜禁食8小时后于腹腔内注射链脲佐菌素(STZ),剂量为30mg/kg,每隔2日于鼠尾处取血测大鼠的空腹血糖(FBG),FBG>7.8mmol/L则认为造模成功,如连续2次以上FBG<7.8mmol/L则认为造模失败。高糖高脂饲料配方:基础饲料65%、猪油10%、蔗糖15%、干蛋黄10%。于T2DM大鼠成模过程中,即高糖高脂饲料喂养第4、8周时,以及成模后,分别随机选取NC组和T2DM组各6只大鼠,禁食8小时后给予20%乌拉坦0.4ml/100g麻醉大鼠后,测定大鼠体重,并经腹主动脉采血,无菌条件下分离血浆2ml分装于无菌EP管内,同时分离血清,上述标本均于-80℃冻存,留取部分肝脏右叶组织,置于包埋盒内迅速投入10%中性福尔马林液24小时后制备腊块。T2DM组成功获得T2DM大鼠20只,取其中体重相近的18只大鼠随机分为持续高糖高脂对照组(简称HSHF组,n=6,继续高糖高脂饲料喂养)、单纯饮食干预组(简称干预I组,n=6,改为普通饲料喂养)、盐酸小檗碱干预组(简称干预II组,n=6,改为普通饲料喂养的基础上给予盐酸小檗碱200mg/kg/d灌胃)。干预8周后,与正常对照组大鼠一起同上处理,测定大鼠体重,留取血浆、血清冻存于-80℃冰箱,制备肝脏右叶组织腊块。同时留取少量结肠内粪便,取2ml置于Rnase EP管内液氮冷冻30分钟后移置-80℃冰箱保存。上述血标本同批测定以下指标,鲎试剂显色基质法测血浆内毒素(LPS),免疫浊度法测血清C反应蛋白(CRP)、谷丙转氨酶(ALT)、血甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG),放免法测空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMAIR),计算公式:FPG(mmol/L)×FINs(m IU/L)/22.5。RT-PCR测定粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌的含量。肝脏蜡块行HE染色,观察肝组织病理学变化。结果:1高糖高脂饮食联合STZ诱发大鼠T2DM形成过程中胰岛素抵抗程度与血内毒素水平之间的关系:1.1第4周末,与NC组相比,T2DM组大鼠体重增加,ALT、TG、CRP、LPS水平升高,FPG、FINS及HOMA-IR无明显变化,差异有统计学意义(P<0.05);T2DM组大鼠的肝脏病理切片可见以小泡性脂滴为主的肝细胞脂肪变性,气球样变。1.2第8周末,与NC组相比,T2DM组大鼠体重增加,ALT、TG、CRP、LPS水平均升高,FPG、FINS及HOMA-IR水平轻度增高,差异有统计学意义(P<0.05);T2DM组大鼠肝脏病理切片观察见以大泡性脂滴为主的肝细胞脂肪变性,气球样变。1.3第14周末,与NC组相比,T2DM组大鼠毛色无光泽,活动少,体重增加较为显著,ALT、TG、CRP、LPS水平显著升高,FPG、FINS显著升高,HOMAIR增大,差异有统计学意义(P<0.05);T2DM组大鼠肝脏组织病理切片观察见肝细胞呈弥漫性空泡样脂肪变性,肝细胞脂肪变性,气球样变,炎性细胞浸润,炎症程度加重。1.4血LPS水平与IR程度之间呈正相关,r=0.740,P<0.01。2.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM可能的作用机制:2.1盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠的疗效:与正常对照组(NC组)相比,干预I组、干预II组大鼠体重、FPG、FINS、ALT、TG均高于NC组(P<0.05);肝脏病理切片可见:肝细胞脂肪变性程度明显于NC组。与持续高糖高脂对照组(HSHF组)比较,干预I组、干预II组大鼠体重、FPG、FINS、ALT、TG均低于HSHF组(P<0.05);肝组织病理切片示:肝细胞脂肪变性,气球样变,少量炎性细胞浸润病变较HSHF组减轻。与干预I组相比,干预II组HOMA-IR、CRP、LPS减少显著(P<0.05);肝细胞脂肪变性程度明显改善于干预I组,炎症浸润显著减少。2.2盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后内毒素水平的变化:与NC组相比,干预I组、干预II组大鼠HOMA-IR、CRP、LPS均高于NC组(P<0.05);与HSHF组比较,干预I组、干预II组大鼠HOMA-IR、CRP、LPS均低于HSHF组(P<0.05);与干预I组相比,干预II组大鼠HOMA-IR、CRP、LPS显著减少(P<0.05)。2.3盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后肠道菌群的变化2.3.1盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后革兰氏阴性菌大肠杆菌属的变化:与NC组相比,干预Ⅰ组、干预Ⅱ组大肠杆菌属丰度减少(P<0.05);与HSHF组相比,干预Ⅰ组、干预Ⅱ组大肠杆菌属丰度减少(P<0.05);与干预Ⅰ组相比,干预Ⅱ组大肠杆菌属减少显著(P<0.05)。2.3.2盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后益生菌乳杆菌属和双歧杆菌属的变化:与NC组相比,干预Ⅰ组、干预Ⅱ组乳酸菌属、双歧菌属丰度增加(P<0.05);与HSHF组相比,干预Ⅰ组、干预Ⅱ组乳酸菌属、双歧菌属丰度增加(P<0.05);与干预Ⅰ组相比,干预Ⅱ组乳酸菌属、双歧菌属丰度增加显著(P<0.05)。结论:1长期高糖高脂饮食引起大鼠体内血LPS水平轻度升高,诱发体内慢性低度炎症,并至肥胖、IR,STZ注射后,胰岛素分泌相对不足,T2DM产生。2盐酸小檗碱治疗T2DM大鼠有效,其可能的部分作用机制是通过改善肠道菌群结构,减少血LPS水平进入机体,从而缓解内毒素血症,进而达到治疗T2DM的目的。