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目的：建立检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、副溶血弧菌及其致病因子的特异、快速检测方法,为临床诊断、卫生防疫、疾病控制提供有效的检测手段.
方法：根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理,以金黄色葡萄球菌femB、SEA基因和副溶血弧菌TDH,TLH因为靶序列,设计并合成引物和荧光探针,对相应病原体进行实时荧光PCR检测,并探讨了PCR体系各因素对定量PCR的影响.
结果：成功建立了金黄色葡萄球菌及其肠毒素A和副溶血弧菌及其溶血素的荧光定量PCR检测方法.
金黄色葡萄球菌及肠毒素A荧光PCR定量检测的最佳镁离子浓度为3.5mmol/L和3.0mmc)1/L,退火温度均为60℃,退火时间均为60s.该方法可定量检测1.0×10<0>1.0x 10<7>拷贝范围之间的样品.对经培养鉴定出金黄色葡萄球菌的68例粪便标本、36例痰液标本、28例脓液标本、22例分泌物、10例尿液标本、6例血液标本进行金葡菌和SEA检测,检测结果与培养结果一致,SFA检出率为15.88﹪.
副溶血弧菌及其溶血素的荧光定量PCR检测的最佳镁离子浓度为3.0mmol/L,退火温度均为60℃,退火时间均为60s.该方法可定量检测1.0×10<0>-1.0×10<7>拷贝范围之间的TDH和TLH基因,TRH基因检测范围为1.0×10<1>-1.0×10<7>拷贝.487份碱性蛋白胨水标本中细菌培养法检出104株副溶血弧菌,检出率为21.4﹪;以TLH基因采用荧光聚合酶链反应检出112份,检出率为23.0﹪,检出携TDH基因菌株101例(90.2﹪,101/112),未检出携带有TRH基因的菌株.
结论：所建立的金黄色葡萄球菌及其肠毒素A和副溶血弧菌及其溶血素荧光定量PCR法敏感性较高、重复性、特异性良好,适合于临床标本检测及大样本量筛查,可为临床诊断,疾病预防控制,食品安全监测奠定方法学基础,同时对流行病学调查具有重要意义.