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背景与目的: 急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)是急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome,ARDS)的早期阶段,是由多种肺内外致病因素引起的一种急性、进行性呼吸衰竭综合征。近年来,随着广谱抗生素的应用和机械通气模式的不断改进,ALI/ARDS的治愈率有所改善,但其死亡率仍接近于30%-40%。ALI/ARDS基本病理生理改变是血管内皮细胞和肺泡上皮细胞通透性增加所致的肺水肿,其发病机制是激活的巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞聚集释放炎症介质促进炎症发展和肺-毛细血管屏障受损而出现肺泡及间质渗出、水肿导致肺泡功能障碍等。炎症反应介导的肺-毛细血管屏障损伤是ALI/ARDS的特征性病理改变,因此抑制炎症反应发生发展并对损伤的肺-毛细血管屏障结构进行修复和功能重建将成为未来治疗ALI/ARDS的发展方向。 内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,在外周循环中对血管内皮的形成、分化及修复起到重要作用。目前研究证实EPCs可以通过修复内皮细胞、抑制炎症反应进展、调节细胞凋亡等方面对ALI的治疗起到一定的作用。本研究旨在建立兔油酸ALI模型,通过静脉注射EPCs探讨其对ALI的修复效应及其可能的作用机制,并为下一步实验研究提供依据。 方法: 1.内皮祖细胞的培养和鉴定:从兔耳中动脉取外周血(5ml/Kg),Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,接种于培养皿中,添加混有EGM-2培养基与10%胎牛血清的培养液,诱导细胞分化,培养至7d鉴定。取培养细胞与10mg/L的DiL-ac-LDL孵育并固定后,加入FITC-UEA-1在激光扫描共聚焦显微镜下进行鉴定。显示DiL-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色阳性的细胞即为正在分化的EPCs。 2.采用注射油酸建立急性肺损伤动物模型,静脉注射EPCs观察其治疗效果:ALI组和ALI+EPC组雄性新西兰兔经耳缘静脉注射20%乳化油酸(75mg/kg),检测呼吸频率及血气分析,建立兔ALI模型。造模成功0.5h后,EPC组和ALI+EPC组兔经耳缘静脉注入EPCs,同时BC组和ALI组兔同样注射方式注入等量PBS液。放血法处死实验动物后取出两肺,检测各组兔多个时间点的肺湿干重比值(W/D)、肺毛细血管通透指数(LPI)在实验后的变化,并用蛋白质印迹法(Western blot)测定核蛋白NF-κB以及肺组织TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR)检测NF-κ B mRNA表达水平。 结果: 1.本课题组参照国内外文献,采用密度梯度离心法分离和培养EPCs。鉴定结果:培养7d后,光镜下观察细胞呈簇状分布,中间核为圆形,外周为梭形,为典型的EPCs集落。此外,取部分细胞用DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定,双染色细胞为分化中的EPCs。 2.通过耳缘静脉将乳化油酸注射入新西兰兔体循环中,实验动物出现呼吸急促,烦躁不安,血气分析提示氧分压(PaO2)降低,计算氧合指数小于300,达到ALI诊断标准,说明动物模型建立成功。 3.ALI组兔肺组织病理可见肺间质毛细血管扩张、充血,肺泡腔和肺间质内可见大量蛋白质浆液及炎性细胞浸润,肺间质内可见点状出血、坏死。ALI+EPC组兔也可见上述表现,但病理变化较ALI组轻。本研究结果显示,注射EPCs后,与ALI组相比,ALI+EPC组兔肺水含量明显降低,PMN浸润数量及出血面积显著减少。本研究发现注射EPCs后,ALI+EPC组兔核蛋白NF-κB以及肺组织NF-κBmRNA、TNF-α和IL-1β表达明显下降。 结论: 1.本研究从兔外周血中成功分离、培养出典型特征的EPCs,对实验动物损害小,无伦理学的争论。本研究采用外周静脉注射油酸建立ALI动物模型,氧合指数及病理结果均提示ALI模型建立成功。 2.移植EPCs能部分改善肺血管通透性,有效地减轻油酸诱导的ALI,其作用机制可能与EPCs归巢入内皮损伤部位,分化为成熟的内皮细胞,修复肺-毛细血管屏障有关。 3.EPCs可以减少ALI兔肺组织TNF-α和IL-1β表达水平,减少ALI时肺组织PMN及蛋白质渗出,说明EPCs可以通过抑制炎症反应从而对ALI起到治疗作用。