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植物病害是世界范围内影响作物产量的最严重的生物胁迫之一，严重影响了作物产量和品质。而80％的作物病害是由病原真菌引起的。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是半知菌亚门丝核菌属的一个种，为死体营养菌，分布广、寄主范围大，常以菌核形态习居土壤，是小麦、玉米、水稻等禾本科作物纹枯病，草坪草褐斑病，马铃薯、棉花、大豆、烟草立枯病的致病菌。虽然该病研究多年，但研究进展较少，主要进展也仅仅集中在生物防治领域。在植物抗病基因工程中，通过将抗真菌蛋白基因转入植物来提高农作物对真菌病害的抗性已成为一种直接有效的方法，并且在一些重要作物改良中取得了一定进展。
本研究通过构建真菌诱导烟草幼苗cDNA文库，并用反向Northern差异筛选法获得一个与生物胁迫相关的Kunitz型蛋白酶抑制剂基因NtKTI1。本研究对NtKTI1基因序列、表达及生物学功能进行了重点分析，主要研究结果如下：
1、利用Clontech SmartTM cDNA Library Construction Kit构建真菌诱导烟草cDNA文库，通过反向Northern差异筛选法分离获得一个长563bp的cDNA片断。应用RACE技术得到这个基因的全长，命名为NtKTI1。该基因全长840bp，编码区长627bp。估计分子量为23.1kDa，等电点为9.36。该基因在GenBank中的注册号为FJ494920。
2、同源比对分析表明NtKTI1与非洲奇果蛋白、植物Kunitz型蛋白酶抑制剂等蛋白具有很高的同源性，分子内有两对二硫键和一个活性中心。使用JPred，SWISSMODEL，CPHmodels和ESyPred3D等蛋白质二级、三级结构数据库在线分析表明NtKTI1与KTI3具有类似的三维结构。随后使用Swiss-Model和RasMol构建了NtKTI1的三维模型。
3、采用生物信息学的手段在拟南芥和水稻基因组数据库中搜寻NtKTI1的同源基因，从拟南芥中找到7个，水稻中仅找到1个。聚类分析表明NtKTI1与AtIg17860，AtIg73260，Os04g0526600聚到一个进化枝上。
4、RT-PCR及Northern表达分析表明NtKTI1在根和茎中表达量最高，其次是花和叶中，在种子中的表达量很低。在尼R.solani，SA和伤处理时，NtKTI1在一定的时间范围内其表达水平随诱导时间的延长而降低，但不受MeJA，ABA和NaCl处理的影响。由PRIc的表达模式推测烟草在立枯丝核菌侵染时的信号转导模式类似于伤信号是依赖SA的信号转导。
5、使用hiTAIL-PCR的方法扩增得到NtKTI1长为1471bp的调控序列，PlantCare预测出多个逆境胁迫响应元件。
6、构建原核表达载体诱导纯化得到缺失信号肽序列而带有组氨酸标签的NtKTI1融合蛋白。酶活测定结果表明该融合蛋白具有胰蛋白酶抑制剂活性。抑菌圈试验结果表明该融合蛋白对立枯丝核菌具有很强的抑菌活性，对桃根霉、烟草疫霉的抑菌活性较弱，但对细菌如E.Coli没有作用。
7、构建NtKTI1的植物正义反义表达载体成功转化烟草，并用NtKTI1特异探针标记进行Northern杂交分析。离体叶片接种实验表明，超表达株系对立枯丝核菌(R. solani)易感性明显降低而反义株系的易感性有所增强。烟草幼苗灌根接种实验表明超表达NtKTI1能有效地提高烟草幼苗对立枯丝核菌的抗性。