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化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种革兰氏阳性致病菌,可引起多种动物的化脓性感染。由对抗生素耐药化脓隐秘杆菌引起的动物疾病成为临床治疗的难题。本课题组的前期研究发现,外排基因tetK和tetL可介导化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素的耐药性。外排泵抑制剂能够抑制耐药菌株对抗生素的外排作用,一定程度上恢复耐药菌株对抗生素的敏感性,筛选高效、低毒的外排泵抑制剂成为当前研究的热点。木犀草素是一种典型的黄酮类化合物,不仅具有抗菌、消炎和抗肿瘤等药理活性,还能够消减某些细菌对大环内酯类、氨基糖苷类抗生素的耐药性。本研究拟通过检测木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素的耐药性、四环素类外排基因及其蛋白的表达变化情况,分析木犀草素消减化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素耐药性的作用及机理,为木犀草素作为抗耐药菌新药的研发和应用奠定理论基础。本研究采用微量肉汤稀释法测定盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、美他环素和土霉素5种四环素类抗生素对木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC),比较MICs的变化情况。结果显示,在亚抑菌浓度(1/2 MIC)木犀草素作用化脓隐秘杆菌36 h后,5种四环素类抗生素对携带外排基因tetK和tetL且耐药的化脓隐秘杆菌的MICs均不同程度下降,而携带外排基因tetK但敏感的化脓隐秘杆菌的MICs未发生改变。提示木犀草素可能是通过抑制化脓隐秘杆菌对抗生素的外排作用,来消减化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素的耐药性。应用荧光定量PCR技术,检测木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌外排基因tetK和tetL mRNA的表达量。结果显示,与药物作用前相比较,木犀草素能够极显著降低耐四环素类抗生素的化脓隐秘杆菌外排基因tetK和tetL mRNA的表达量,而对携带外排基因tetK但对四环素类抗生素敏感的化脓隐秘杆菌的mRNA表达量无显著性影响;外排基因tetK和tetL mRNA表达变化结果与MICs变化结果基本一致。构建tetK基因的原核表达载体,制备TetK蛋白;免疫家兔,制备兔抗化脓隐秘杆菌TetK蛋白多克隆抗体;利用Western Blot技术,对木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌TetK蛋白的表达量进行检测。结果显示,木犀草素能够极显著降低耐四环素类抗生素的化脓隐秘杆菌TetK蛋白的表达量,而携带外排基因tetK但对四环素类抗生素敏感菌株的TetK蛋白的表达量与药物作用前相比无显著性变化;TetK蛋白表达变化趋势与MICs及tetK基因mRNA表达变化趋势基本一致,且该试验结果与对照药物利血平的作用一致,提示木犀草素可能是通过抑制TetK蛋白的表达而消减化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素的耐药性。该研究表明,木犀草素可能通过抑制化脓隐秘杆菌外排基因tetK和tetL mRNA表达及外排蛋白TetK的表达来消减其对四环素类抗生素的耐药性。本研究将为深入研究木犀草素消减细菌的耐药机制及其作为新型抗菌药物的研发奠定坚实的理论基础。