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研究背景与目的:
Crumbshomologue1(CRB1)基因突变是导致遗传性视网膜疾病视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)的原因之一。CRB1编码的CRBI包含可变的细胞外结构域和保守的细胞内结构域,是调控上皮细胞顶端一基底极性的关键分子。脊椎动物基因组编码多种crb同源物,其中斑马鱼crb2a与人类CRB1高度同源。斑马鱼视网膜神经上皮细胞和晶状体上皮细胞间的顶端区域可形成黏附连接(adherencejunctions,AJs)并组装成带状黏连(zonula adherens,ZAs)。敲除crb2a可导致斑马鱼上皮细胞极性破坏、AJs断裂,并诱导视网膜形态发生缺陷。然而,Crb2a的细胞内和细胞外结构域在AJs形成过程中的具体机制尚不明确。
本研究旨在通过斑马鱼模型,探究斑马鱼Crb2a的细胞内和细胞外结构域对视网膜和晶状体上皮细胞顶端AJs形成和装配的调控机制,并进一步揭示CRB1相关遗传性视网膜疾病的分子生物学机制。
研究方法:
本研究用聚合酶链式反应合成了缺乏Crb2a细胞外结构域的Crb2aAEX,以AB系野生型和转基因crb2am289、OE120;WT、Crb2a△EX;crb2am289斑马鱼为模型,利用冰冻切片免疫组化、高分辨率透射电镜照相等实验技术研究了Crb2a△EX与外界膜完整性、极性蛋白定位、视网膜片层化结构形态、上皮细胞AJs装配形式等生物学组织和事件的影响和机制,探讨了CRB1相关视网膜色素变性患者的表型和斑马鱼OE120;WT的表型联系及基因型关系,利用统计学方法定量分析了Crb2a△EX对斑马鱼视网膜神经上皮细胞和晶状体上皮细胞间黏着斑形成的数量和黏附连接的装配形式。
研究结果:
研究结果显示,表达Crb2aAEX不但可以部分挽救AJs组装,还可以挽救Crb2a缺失引起的视网膜形态缺陷。具体而言,在Crb2a△EX;crb2am289斑马鱼中,Crb2a△EX稳定了视网膜感光细胞中Nok的膜相关定位,并有效地抑制了Crb2a缺失引起的细胞异常增殖。同时,Crb2a△EX促进了斑马鱼视网膜神经上皮细胞和晶状体上皮细胞AJs的顶端分布,但使其装配成不稳定的黏着斑。此外,Crb2a△EX显著促进了极性蛋白Nok/ZOI的顶端极性定位,以及处于M期有丝分裂阶段pH3阳性细胞的顶端极性定位;Crb2a△EX还使视网膜神经上皮中的定位在顶端的黏着斑数量增加(比crb2am289斑马鱼高7.5倍),并修复了Crb2a△EX;crb2am289斑马鱼中的视网膜片层化结构。然而,Crb2a△EX对上皮细胞中的ZAs和感光细胞中外界膜的形成并没有修复作用。相比之下,Crb2a△EX在野生型斑马鱼中的表达破坏了外界膜的完整性,还影响了内源性极性蛋白在感光细胞中的正确定位,并最终导致以感光细胞进行性减少的RP样退化。CRB1突变RP患者青少年期开始发生视网膜退化,以外界膜和感光细胞外核层退化最为明显。
研究结论:
本研究揭示了Crb2a细胞内和细胞外结构域在视网膜和晶状体上皮细胞AJs的分布、装配等生物过程中的不同功能:Crb2a的细胞内结构域和细胞外结构域是维持视网膜和晶状体上皮细胞顶端ZAs稳态的必要蛋白结构;Crb2a细胞内结构域能促进黏附连接的顶端极性分布;Crb2a细胞外结构域能介导细胞间不稳定的点状黏连向稳定的ZAs转化;过表达Crb2a细胞内结构域可促进斑马鱼产生RP样退化,该模型较好地模拟了CRB1突变RP患者的疾病进程和临床表现。
Crumbshomologue1(CRB1)基因突变是导致遗传性视网膜疾病视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)的原因之一。CRB1编码的CRBI包含可变的细胞外结构域和保守的细胞内结构域,是调控上皮细胞顶端一基底极性的关键分子。脊椎动物基因组编码多种crb同源物,其中斑马鱼crb2a与人类CRB1高度同源。斑马鱼视网膜神经上皮细胞和晶状体上皮细胞间的顶端区域可形成黏附连接(adherencejunctions,AJs)并组装成带状黏连(zonula adherens,ZAs)。敲除crb2a可导致斑马鱼上皮细胞极性破坏、AJs断裂,并诱导视网膜形态发生缺陷。然而,Crb2a的细胞内和细胞外结构域在AJs形成过程中的具体机制尚不明确。
本研究旨在通过斑马鱼模型,探究斑马鱼Crb2a的细胞内和细胞外结构域对视网膜和晶状体上皮细胞顶端AJs形成和装配的调控机制,并进一步揭示CRB1相关遗传性视网膜疾病的分子生物学机制。
研究方法:
本研究用聚合酶链式反应合成了缺乏Crb2a细胞外结构域的Crb2aAEX,以AB系野生型和转基因crb2am289、OE120;WT、Crb2a△EX;crb2am289斑马鱼为模型,利用冰冻切片免疫组化、高分辨率透射电镜照相等实验技术研究了Crb2a△EX与外界膜完整性、极性蛋白定位、视网膜片层化结构形态、上皮细胞AJs装配形式等生物学组织和事件的影响和机制,探讨了CRB1相关视网膜色素变性患者的表型和斑马鱼OE120;WT的表型联系及基因型关系,利用统计学方法定量分析了Crb2a△EX对斑马鱼视网膜神经上皮细胞和晶状体上皮细胞间黏着斑形成的数量和黏附连接的装配形式。
研究结果:
研究结果显示,表达Crb2aAEX不但可以部分挽救AJs组装,还可以挽救Crb2a缺失引起的视网膜形态缺陷。具体而言,在Crb2a△EX;crb2am289斑马鱼中,Crb2a△EX稳定了视网膜感光细胞中Nok的膜相关定位,并有效地抑制了Crb2a缺失引起的细胞异常增殖。同时,Crb2a△EX促进了斑马鱼视网膜神经上皮细胞和晶状体上皮细胞AJs的顶端分布,但使其装配成不稳定的黏着斑。此外,Crb2a△EX显著促进了极性蛋白Nok/ZOI的顶端极性定位,以及处于M期有丝分裂阶段pH3阳性细胞的顶端极性定位;Crb2a△EX还使视网膜神经上皮中的定位在顶端的黏着斑数量增加(比crb2am289斑马鱼高7.5倍),并修复了Crb2a△EX;crb2am289斑马鱼中的视网膜片层化结构。然而,Crb2a△EX对上皮细胞中的ZAs和感光细胞中外界膜的形成并没有修复作用。相比之下,Crb2a△EX在野生型斑马鱼中的表达破坏了外界膜的完整性,还影响了内源性极性蛋白在感光细胞中的正确定位,并最终导致以感光细胞进行性减少的RP样退化。CRB1突变RP患者青少年期开始发生视网膜退化,以外界膜和感光细胞外核层退化最为明显。
研究结论:
本研究揭示了Crb2a细胞内和细胞外结构域在视网膜和晶状体上皮细胞AJs的分布、装配等生物过程中的不同功能:Crb2a的细胞内结构域和细胞外结构域是维持视网膜和晶状体上皮细胞顶端ZAs稳态的必要蛋白结构;Crb2a细胞内结构域能促进黏附连接的顶端极性分布;Crb2a细胞外结构域能介导细胞间不稳定的点状黏连向稳定的ZAs转化;过表达Crb2a细胞内结构域可促进斑马鱼产生RP样退化,该模型较好地模拟了CRB1突变RP患者的疾病进程和临床表现。