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对广玉兰(Magnolia grandiflora)、香子含笑(Michelia hedyosperma)、三瓣木兰(Magnolia tripetala)和白花除虫菊(Pyrethrum cinerariifolium)四种植物进行内生微生物的分离,获得内生微生物共计465株,其中内生真菌335株,内生细菌130株。前期工作中王兴彪从一品红(Euphorbia pulcherrima)、白花除虫菊(Pyrethrumcinerariifolium)、白亮独活(Heracleum candicans)和印楝(Azadirachta indica)四种植物中分离得到55株内生细菌。对这些内生微生物进行杀线虫活性及抗菌活性筛选。根据筛选结果,选择内生真菌MY22、YLF-3和内生细菌LCB-3、LLB-6(一)进行化学成分的分离鉴定,取得以下结果:
1.对以上提到的七种植物中分离获得的520株内生微生物进行杀线虫活性筛选,获得有活性的菌株62株,其中真菌26株,细菌36株。在这些菌株中,从广玉兰(M。grandiflora)中分离到内生微生物91株,活性内生真菌和细菌分别有6株和7株。从香子含笑(M.hedyosperma)中分离到内生微生物154株,活性内生真菌和细菌分别有8株和2株。从三瓣木兰(M.tripetala)中分离到内生微生物152株,活性内生真菌和细菌分别有11株和4株。从白花除虫菊(P.cinerariifolium)中分离到内生微生物94株,其中活性内生真菌和细菌分别有1株和12株。从一品红(E.pulcherrima)中分离得到内生细菌14株,其中活性菌株有6株。从白亮独活(H.candicans)中分离得到内生细菌10株,其中活性菌株有3株。从印楝(A.indica)中分离得到内生细菌5株,其中活性菌株有2株。在获得的活性菌株中,内生真菌MY22、YLF-3和内生细菌LCB-3活性强,发酵条件稳定,作为进一步研究的对象。
2.对从一品红(E.pulcherrima)、白花除虫菊(P.cinerariifolium)、白亮独活(H。candicans)和印楝(A.indica)四种植物中分离得到的55株内生细菌进行抗菌活性筛选。获得对淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)有活性的菌株18株,对白色念珠球菌(Candida albicans)有活性的菌株16株,对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)有活性的菌株31株,对金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus)有活性的菌株12株。其中内生细菌LLB-6(一)抗菌活性最强,作为进一步研究的对象。
3.通过形态学并结合ITS序列分析,将内生真菌MY22鉴定为深绿木霉(Trichoderma atroviride),YLF-3为木霉属真菌(Tr ichoderma sp.);经16S rDNA序列聚类分析,将内生细菌LCB-3鉴定为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta),LLB-6(一)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
4.从内生真菌MY22中分离得到化合物MYZ2-1、MYZ2-2、MYZ2-3和MY22-5,经鉴定其分别为cyclonerodiol、5α,8α-epidioxyergosta-6,22-diem-3β-ol、(E)-2,3-dihydroxypropyl octadec-9-enoate(glyceryl palmitoleate)、(E)-2,3-methylpentadec-8-enoate。从内生真菌YLF-3中分离得到化合物YLF-3-1、YLF-3-2、YLF-3-3,经鉴定其分别为trichodermone A、trichodermone B、3-(3-oxocyclopent-1-enyl)propanoic acid。其中trichodermone A和trichodermone B为新化合物。从内生细菌LCB-3中分离得到化合物(R)-(-)-2-ethylhexan-1-ol。从内生细菌LLB-6(一)中分离得到化合物2-amino-3-phenylpropanoic acid和iturinA-2。活性测定表明:化合物MYZ2-1在浓度800mg liter-1时对全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)表现出微弱的毒杀活性,并对淡紫拟青霉(P.lilacinus)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)有不同程度的抑制活性。化合物MYZ2-2在浓度400mg liter-1时对全齿复活线虫(P.redivivus)和松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)表现出毒杀活性,该化合物对淡紫拟青霉(P.lilacinus)有抑制活性。化合物YLF-3-3对蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)有抑制作用。化合物LCB-3-1在浓度为800mg liter-1时对全齿复活线虫(P.redivivus)和松材线虫(B.xylophilus)表现出毒杀活性。化合物LLB-6-12对淡紫拟青霉(P.lilacinus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)有显著抑制活性。