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Leber遗传性视神经病变(Lebers Hereditary Optic Neuropathy，LHON)是线粒体母系遗传性的眼病，主要累及视网膜神经节细胞（retainal ganglion cells，RGCS）及乳头黄斑束。在欧洲及亚洲均有90%以上的LHON患者携带有原发突变，即：m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C。其中在欧洲LHON人群中，m.3460G＞A携带率为15~25%，而国内为1.4%。Erickson等人发现线粒体基因组（mitochondria DNA，mtDNA）突变是LHON发病的主要分子基础，但其致病机制依然不清楚。本课题在核背景一致的前提下，从分子水平上深入研究m.3460G＞A突变与LHON之间的相关性。
目的：通过构建携带m.3460G＞A突变的转线粒体细胞系，进一步探究突变对线粒体功能，自噬和凋亡水平的影响。
方法：首先对从2005年-2018年收集到的1218例LHON血样进行线粒体DNA提取、m.3460G＞A位点筛查。选择其中1个具有典型LHON的家系做为本课题的研究对象，用抗凝外周血测线粒体DNA全序，确定其单体型。用限制性内切酶检测突变对天然酶切位点的影响。此外，用专业的生物学软件（PredictProtein）预测突变前后ND1的二级结构。然后用聚乙二醇（PEG）诱导法将冻存的血小板与ρ0206细胞（无线粒体）进行融合[3-5]，构建具有相同核背景的融合细胞系做为突变组（Mutant groups）。同时在已经建立的融合细胞样本库中寻找单体型相同的细胞系做为正常对照者(Control groups)，然后将这两组细胞分别在线粒体呼吸链复合体蛋白表达量、细胞和线粒体ATP产量、细胞活性氧类（Reactive Oxygen Species，ROS）、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）、自噬（Autophagy）、细胞凋亡（Apoptosis）等方面的变化进行比较。
结果：从收集到的1218例LHON样本中筛查出17例患者携带m.3460G＞A突变。选取编号为WZ1504家系的先证者做为研究对象，其线粒体单体型是D4（http://www.phylotree.org/tree/main.htm）。PredictProtein预测结果显示m.3460G＞A突变改变了ND1蛋白编码区的二级结构。突变导致限制性的酶切位点消失。生化功能实验结果表明：正常对照组和突变组的细胞氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）时ATP水平均未受影响，但是跟前者相比，后者糖酵解时线粒体ATP产量降低了约29%（P=0.0011）；ROS增高了约56.9%（P＜0.0001）；线粒体膜电位降低了约30%（P＜0.0001）；早期凋亡细胞增加约83.9%（P＜0.0001）。Western Blot结果显示：跟正常对照组相比，突变组的线粒体复合体I上ND1编码区的蛋白表达量降低了40.3%（P=0.0129），其他复合体上的蛋白表达量未受突变的影响；核蛋白表达的抗氧化酶SOD1、SOD2、Catalase分别增加约50%(P=0.0009),23.01%(P=0.0413)和40%(P=0.0048)；细胞自噬标志物LC3下降约22%（P＜0.0001），自噬受体Beclin-1增加约71%（P＜0.0001），在线粒体介导的PINK1-Parkin自噬通路中，二者的蛋白水平分别下降49%（P＜0.0001）、30%（P＜0.0001）；凋亡相关因子Bak、Bax、CytC分别增加约了67.9%（P=0.0179）、26.2%（P=0.0327）、47%（P=0.0002），Cleaved Caspase-3、7、9、PARP分别增加了40.2%（P＜0.0001）、43.3%（P＜0.0001）、59.7%（P＜0.0001）、42.6%（P＜0.0001）。
结论：MT-ND13460G＞A突变影响了线粒体生化功能、细胞自噬和凋亡水平，导致视网膜神经节细胞能量供应障碍，最终导致视力损伤的发生。
目的：通过构建携带m.3460G＞A突变的转线粒体细胞系，进一步探究突变对线粒体功能，自噬和凋亡水平的影响。
方法：首先对从2005年-2018年收集到的1218例LHON血样进行线粒体DNA提取、m.3460G＞A位点筛查。选择其中1个具有典型LHON的家系做为本课题的研究对象，用抗凝外周血测线粒体DNA全序，确定其单体型。用限制性内切酶检测突变对天然酶切位点的影响。此外，用专业的生物学软件（PredictProtein）预测突变前后ND1的二级结构。然后用聚乙二醇（PEG）诱导法将冻存的血小板与ρ0206细胞（无线粒体）进行融合[3-5]，构建具有相同核背景的融合细胞系做为突变组（Mutant groups）。同时在已经建立的融合细胞样本库中寻找单体型相同的细胞系做为正常对照者(Control groups)，然后将这两组细胞分别在线粒体呼吸链复合体蛋白表达量、细胞和线粒体ATP产量、细胞活性氧类（Reactive Oxygen Species，ROS）、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）、自噬（Autophagy）、细胞凋亡（Apoptosis）等方面的变化进行比较。
结果：从收集到的1218例LHON样本中筛查出17例患者携带m.3460G＞A突变。选取编号为WZ1504家系的先证者做为研究对象，其线粒体单体型是D4（http://www.phylotree.org/tree/main.htm）。PredictProtein预测结果显示m.3460G＞A突变改变了ND1蛋白编码区的二级结构。突变导致限制性的酶切位点消失。生化功能实验结果表明：正常对照组和突变组的细胞氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）时ATP水平均未受影响，但是跟前者相比，后者糖酵解时线粒体ATP产量降低了约29%（P=0.0011）；ROS增高了约56.9%（P＜0.0001）；线粒体膜电位降低了约30%（P＜0.0001）；早期凋亡细胞增加约83.9%（P＜0.0001）。Western Blot结果显示：跟正常对照组相比，突变组的线粒体复合体I上ND1编码区的蛋白表达量降低了40.3%（P=0.0129），其他复合体上的蛋白表达量未受突变的影响；核蛋白表达的抗氧化酶SOD1、SOD2、Catalase分别增加约50%(P=0.0009),23.01%(P=0.0413)和40%(P=0.0048)；细胞自噬标志物LC3下降约22%（P＜0.0001），自噬受体Beclin-1增加约71%（P＜0.0001），在线粒体介导的PINK1-Parkin自噬通路中，二者的蛋白水平分别下降49%（P＜0.0001）、30%（P＜0.0001）；凋亡相关因子Bak、Bax、CytC分别增加约了67.9%（P=0.0179）、26.2%（P=0.0327）、47%（P=0.0002），Cleaved Caspase-3、7、9、PARP分别增加了40.2%（P＜0.0001）、43.3%（P＜0.0001）、59.7%（P＜0.0001）、42.6%（P＜0.0001）。
结论：MT-ND13460G＞A突变影响了线粒体生化功能、细胞自噬和凋亡水平，导致视网膜神经节细胞能量供应障碍，最终导致视力损伤的发生。