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目的:骨骼是人体一种钙化的结缔组织,通过不断地进行更新和重塑来维持高度的动态平衡。正常骨代谢对机体内维持矿物质的稳态和骨骼结构的完整性有重要作用,其中由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成是维持骨稳态的两个核心过程,受多种因素调控,包括细胞因子、激素和机械刺激等。骨代谢的平衡被破坏就会引起骨骼微结构紊乱为主要表现的疾病的发生。比如破骨细胞介导的骨吸收占主导后出现病理性骨吸收为主的骨质疏松症。骨质疏松症常常引起骨折而导致了高致残率与死亡率,将严重影响个人生活质量,给家庭和社会带来了极大的经济负担。因此,深入研究骨质疏松的发病机制及对指导骨质疏松临床预防与治疗具有重要意义。近年来研究表明,氧化应激对破骨细胞和成骨细胞造成损伤,使之功能失调,是引起骨质疏松发病的原因之一。氧化应激主要是由于氧自由基（尤其是ROS）与抗氧化处理能力失衡引起的。核转录因子NF-E2相关因子2（Nuclear factor erythroidderived 2-like 2,NFE2L2,简称Nrf2）是一种调控机体适应性抗氧化反应的重要转录因子,并且与骨代谢密切相关。但Nrf2对骨代谢的影响具有多重性与不确定性,Nrf2在破骨细胞分化过程中起到重要的作用,Nrf2可以通过上调抗氧化酶表达降低细胞内的ROS水平而抑制破骨细胞的分化,科室的前期结果也表明,Nrf2的缺失可导致小鼠对外来刺激的敏感性增加,更容易出现骨质疏松。另一方面,动物实验已经显示骨组织Nrf2的缺失将会导致骨量下降表现为低骨密度。前期结果也表明,与野生对照组相比,小鼠Nrf2敲除后,股骨和锥体的骨强度会降低,负荷诱导的骨形成也将明显的降低。因此本研究通过应用全身性Nrf2敲除小鼠建立卵巢摘除小鼠模型、老龄化小鼠模型、轮转式运动小鼠模型,旨在明确Nrf2在骨代谢中的作用并通过体外细胞实验对Nrf2在破骨细胞分化中的作用及机制进行研究,为临床骨质疏松的预防与治疗提供新的靶点和理论依据。研究方法:1.建立雌激素缺失性骨质疏松模型:选取全身性Nrf2敲除（Nrf2-KO）及同窝野生型（Nrf2-WT）雌性小鼠各12-15只,12周龄随机分为两组,一组为去势手术造模组（OVX）,通过双侧去卵巢法建立去势小鼠模型;一组为假手术对照组（Sham）。术后每周测量小鼠体重,监测小鼠进食量及饮水量,体成分分析等基础指标。直至28周造模结束后,测量小鼠空腹血糖,二氧化碳麻醉收集小鼠眼球血液进行血浆骨吸收标志物TRAP-5b和CTX1及血浆骨形成标志物P1NP的测定,收集各脏器进行称重。准备右侧股骨进行Micro-CT扫描分析。2.老年型骨质疏松模型:应用Nrf2-KO小鼠及Nrf2-WT雌性小鼠,每组12-15只。饲养至24周每个基因型随机选取6-8只结束造模,作为对照组（Cont）进行二氧化碳麻醉收集小鼠眼球血液进行血浆骨吸收标志物TRAP-5b和CTX1的测定。收集左侧股骨进行组织病理学TRAP染色,右侧股骨进行Micro-CT扫描分析。余下小鼠继续饲养至65周龄结束造模。作为老年组（Aged）进行相关实验,检测方法同对照组。3.利用体外细胞实验研究Nrf2在破骨细胞分化过程中的分子机制:以同窝雄性Nrf2-KO和Nrf2-WT小鼠的原代骨髓造血干细胞细胞作为实验材料,给予RANKL诱导分化处理,检测ROS水平及破骨细胞分化能力与其下游基因的表达;应用鼠源破骨细胞系RAW 264.7进行慢病毒稳转沉默NRF2基因,沉默组（NRF2-KD）与对照组（Scramble）分别进行诱导分化以及给予NAC、DPI和Mito-Q处理后再诱导分化,检测ROS水平、定位及破骨细胞分化能力与其下游基因的表达。应用两种不同基因型的RAW264.7细胞进行慢病毒稳转沉默c-Fos基因以及特异性抑制剂处理,检测NRF2-KD组与Scramble组破骨细胞分化能力。4.小鼠被迫轮转式运动模型:选取16周龄Nrf2-KO及Nrf2-WT雌性小鼠各12-15只,随机分为运动造模组（Exercise）及相对静止组（Sedentary）。Exercise组小鼠给予被迫轮转式运动,每天运动60min,速度为10米/min。期间Sedentary组小鼠于饲养笼内未给予任何处理。运动实验过程中每周监测小鼠体重、体成分分析。12周后造模结束。测量小鼠空腹血糖水平,收集各脏器进行称重,二氧化碳麻醉收集小鼠眼球血液进行血浆骨吸收标志物TRAP-5b和CTX1及血浆骨形成标志物P1NP的测定。并对右侧股骨进行Micro-CT扫描及另一侧股骨进行HE染色。5.去势手术后被迫轮转式运动模型:选取12周龄Nrf2-KO及Nrf2-WT雌性小鼠各14-18只,给予去势手术,术后4周将各基因型小鼠随机分为两组,一组为去势后运动造模组（OVX-Exercise）,给予被迫轮转式运动,另一组为去势后相对静止组（OVX-Sedentary）,未给予任何处理。运动干预方式同方法4,实验期间每周监测小鼠体重及体成分分析。12周后造模结束,测量空腹血糖水平。采用MicroCT检测骨密度并收集病理切片进行HE染色及血清学指标检测。研究结果:1.Nrf2缺失小鼠对因雌激素缺失或老龄化所引起骨质疏松的敏感性增加。去势手术组及老年组小鼠出现骨量下降,并且全身性Nrf2敲除后小鼠骨质疏松程度加重。分别对Nrf2-KO及Nrf2-WT小鼠股骨进行Micro-CT扫描分析及特异性病理染色发现,去势手术造模后,各基因型小鼠均出现骨质疏松,Nrf2-KO组小鼠表现更为明显。对骨松质骨小梁进行数据分析发现:去势手术组与假手术组相比,骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数目（Tb.N）出现降低,Nrf2-KO组与Nrf2-WT组相比,下降更为明显,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。在老年性骨质疏松造模实验中,与对照组相比,老年Nrf2-KO组小鼠的骨体积分数（BV/TV）出现减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。骨小梁数目（Tb.N）减少,骨小梁间距（Tb.Sp）增加,但并无统计学意义。进行TRAP病理染色分析,与Nrf2-WT组相比,Nrf2-KO组的破骨细胞数量出现明显增加;血浆TRAP-5b及CTX1测定显示老年Nrf2-KO组小鼠较老年Nrf2-WT显著增高,以上差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.Nrf2缺失通过升高细胞质内及线粒体内ROS水平以及激活c-Fos促进破骨细胞分化。给予BMMs和RAW 264.7细胞进行诱导分化发现:Nrf2缺失后代表破骨细胞分化能力的TRAP染色增多以及破骨细胞分化相关基因Cathepsin K、H+-ATPase、Atp6v0d2及NFATC1的表达水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;而在RAW 264.7细胞中过表达Nrf2发现TRAP染色减少及破骨细胞分化相关基因表达下降;RAW 264.7给予RANKL处理后通过流式检测ROS,Nrf2沉默后ROS水平明显升高;Mito-Sox及Mito-Red染色发现15min时ROS集中于细胞质内,而24-48h在细胞质与线粒体均可以检测到。给予3种不同作用机制的ROS抑制剂处理NRF2-KD细胞与Scramble细胞,均可发现TRAP染色减少以及破骨细胞分化相关基因Cathepsin K、H+-ATPase、Atp6v0d2以及NFATC1的表达水平降低。c-Fos沉默及抑制剂处理NRF2-KD细胞与Scramble细胞后,也出现了TRAP染色减少以及破骨细胞分化相关基因Cathepsin K、H+-ATPase、Atp6v0d2的表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.Nrf2缺失使小鼠对因运动引起骨量增加的敏感性降低,但对去势后再运动所致骨量的增加无影响。16周小鼠给予被动运动后,股骨Micro-CT扫描分析显示:运动组小鼠骨体积分数（BV/TV）上升,骨小梁厚度（Tb.Th）增加,当Nrf2敲除后,与Nrf2-WT组相比,运动后较运动前所致骨量增加的比率降低,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。血清学检测骨形成标志物P1NP,运动后出现增加,且与Nrf2-WT组相比,Nrf2-KO组增加不明显。而在去势手术后再运动组,与去势手术后相对静止组相比,无论Nrf2-KO组还是Nrf2-WT组,运动均可以使骨量增加。Nrf2-KO组与Nrf2-WT组,BV/TV、Tb.Th显示减少。Tb.Sp、Tb.N则显示增加,以上差异无意义。结论:1.去势手术及老龄化均可诱发骨量减少,全身性Nrf2敲除小鼠对雌激素缺失及老龄化所致的骨质疏松更加敏感,并主要表现为增加破骨细胞数量及增强破骨细胞功能。这表明Nrf2在骨质疏松发生过程中发挥重要作用。2.Nrf2的缺失可使破骨细胞分化增强;在破骨细胞分化15-30分钟内发现细胞质内ROS水平升高,而在24-48小时发现细胞质内及线粒体内ROS水平均升高;给予ROS抑制剂后阻断了因Nrf2缺失所致的破骨细胞分化增强,同时给予c-Fos沉默及抑制剂处理后,破骨细胞分化也出现了下降。我们得出Nrf2的缺失通过升高细胞质内及线粒体内ROS水平及增加c-Fos的表达来促进破骨细胞分化。3.运动可使小鼠股骨的骨量增加,全身性Nrf2敲除后小鼠对因运动所致的骨量增加的敏感性降低,考虑可能与成骨细胞的分化能力增强相关;而去势手术后小鼠再运动也可使小鼠骨量增加,但Nrf2的敲除对运动所致的骨量增加并无影响。