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目的:探讨内源性大麻素系统中大麻素受体2（cannabinoids receptors 2,CB2R）与老年人群骨质异常的关系,分析大麻素受体2对破骨细胞形成的影响及其内部机制,从而为进一步治疗老年人群骨质疏松症提供新的靶点。方法:1、临床标本采集:中国医科大学附属第一医院老年医学科就诊的年龄大于60岁患者255例,排除急性心脑血管疾病、风湿免疫系统疾病、精神心理疾病、血液系统疾病、恶性肿瘤等能够引起继发性骨质疏松的疾病,对所有研究对象应用双能X线吸收法（dualenergy X-ray absorptiometry,DXA法）行骨密度检测,并依腰椎DXA结果将研究对象分为骨量正常组（T≥-1.0）和骨量异常组（T＜-1.0）,并对每组研究对象提取外周血血清进行白蛋白、前白蛋白、碱性磷酸酶、钙、磷、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、总甘油三酯、尿酸及骨代谢标志物检测。以上述入选标准同时分别选取23例患者和9例患者,依腰椎DXA结果分为骨量正常组（T≥-1.0）、骨量减少组（-2.5＜T＜-1.0）及骨质疏松组（T≤-2.5）,行外周血单个核细胞提取后进行反转录PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）及Western blotting观察大麻素受体2的表达情况,并分析其与骨质异常的关系。2.细胞学实验:（1）采用小鼠单核细胞RAW264.7,应用RANKL（receptor activator of the Nfk B ligand,核因子k B活化受体配体）诱导其分化构建破骨细胞分化模型。分别采用CB2受体激动剂AM1241及CB2受体拮抗剂AM630对此分化过程进行干预,行抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色及TRAP活性测定观察破骨细胞形成情况。对分化的各组细胞进行蛋白提取后行WB检测,检测核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）及血红素加氧酶-1蛋白（Heme oxygenase-1,HO-1）的表达情况。（2）制备si-Nrf2慢病毒质粒干扰载体,应用si-Nrf2慢病毒质粒干扰载体对RAW264.7细胞进行转染后再进行RANKL诱导破骨细胞分化,并分别采用AM1241及AM630对分化过程进行干预。提取细胞蛋白行western blotting检测Nrf2及HO-1蛋白的表达情况,并行TRAP染色及TRAP活性测定观察破骨细胞形成情况。3.统计学分析:临床资料统计学分析均采用SPSS 22.0统计软件进行,根据数据分布的不同类型分别采用T检验、Kruskal Wallis秩和检验或卡方检验、Fisher检验及单因素方差分析（one-way ANOVA）,计量资料以均数±标准差（（?）±S）或中位数（四分位数范围）表示,计数资料以率表示。临床基本资料、生化指标、骨代谢标志物及CB2受体m RNA含量与腰椎骨密度的相关性采用Pearson相关分析。控制年龄、性别、BMI、ALB、PAB、TC、LDL-C、SUA混杂因素的影响,分别以骨代谢标志物中各项为自变量、腰椎骨密度为因变量进行多元线性回归分析;将研究对象分为骨量正常组和骨量异常组,按骨代谢标志物中的β-Crosslaps、Osteo C及T-P1NP的四分位数（1-4）分组,分别以β-Crosslaps、Osteo C及T-P1NP的四分位数为自变量,腰椎骨密度为因变量进行二元Logistic回归分析,并进一步应用两个模型进行线性趋势检验,模型1为未调整任何变量,模型2为调整年龄、性别、BMI、ALB、PAB、TC、LDL-C及SUA。控制年龄、性别混杂因素的影响,以外周血中CB2受体m RNA含量为自变量,腰椎骨密度为因变量进行多元线性回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。细胞学实验数据统计分析使用Graph Pad Prism 5.0版软件。数据结果表示为至少三个独立实验的均数±标准差（（?）±S）,配对组比较采用配对T检验,多组比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.255例患者随着腰椎骨密度的降低,女性所占比例升高、BMI值降低、前白蛋白降低、血清尿酸降低,总甘油三酯降低,骨量正常组与骨量异常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,相关性分析示腰椎骨密度值与前白蛋白（R=0.14,P＜0.05）、血尿酸（R=0.29,P＜0.01）呈正相关,与血钙（R=-0.15,P＜0.05）、总胆固醇（R=-0.16,P＜0.05）呈负相关。骨量正常组与骨量异常组比较,骨代谢标志物β-Crosslaps、Osteo C及T-P1NP值偏低,组间差异有统计学意义（P＜0.05）,相关性分析示腰椎骨密度值与β-Crosslaps（R=-0.22,P＜0.01）、Osteo C（R=-0.22,P＜0.01）、T-P1NP（R=-0.13,P＜0.05）均呈负相关。以骨代谢标志物为自变量,腰椎骨密度为因变量进行多元线性回归分析,未调整变量时,β-Crosslaps、Osteo C及T-P1NP均与腰椎骨密度显著相关（P＜0.01）;调整年龄、性别、BMI、ALB、PAB、TC、LDL-C、SUA混杂变量后,β-Crosslaps与腰椎骨密度显著相关（P＜0.05）,Osteo C及T-P1NP与腰椎骨密度相关性消失。进一步以β-Crosslaps四分位数为自变量,腰椎骨密度为因变量进行二元Logistic回归分析,发现未调整任何变量时,以β-Crosslaps第1分位为对照组,β-Crosslaps第2、3、4分位骨密度降低风险OR值分别为0.64（95%CI 0.30-1.36,P=0.254）、1.10（95%CI 0.53-2.26,P=0.801）、2.78（95%CI 1.37-5.76,P=0.005）,线性趋势P=0.002,当调整变量年龄、性别、BMI、ALB、PAB、TC、LDL-C及SUA后,以β-Crosslaps第1分位为对照组,β-Crosslaps第4分位骨密度降低风险OR值为2.35（95%CI 1.02-5.52,P=0.047）。分别以Osteo C及T-P1NP四分位数为自变量,腰椎骨密度为因变量进行二元Logistic回归分析,未调整任何变量时,以Osteo C第1分位组为对照组,Osteo C第2、3、4分位组骨密度降低风险OR值分别为1.75（95%CI 0.85-3.64,P=0.132）、1.16（95%CI0.54-2.48,P=0.709）、3.05（95%CI 1.48-6.41,P=0.003）,线性趋势P=0.011,当调整年龄、性别、BMI、ALB、PAB、TC、LDL-C及SUA变量后,Osteo C与LBMD降低的相关性消失;无论调整变量与否,均未发现T-P1NP与LBMD独立相关。2.23例患者进行PBMC提取后行CB2受体m RNA检测,结果示骨量减少组及骨质疏松组与骨量正常组比较,CB2受体m RNA表达量均发生下调性改变,三组差异有统计学意义（P＜0.05）,相关性分析示CB2受体m RNA表达量与腰椎骨密度（R=0.675,P＜0.05）呈显著正相关,多元线性回归分析示CB2受体m RNA表达量与腰椎骨密度显著相关（P＜0.05）,调整年龄、性别变量后,CB2受体m RNA表达量与腰椎骨密度相关的显著性未受到影响。9例患者进行PBMC提取后行CB2受体蛋白检测,骨量减少组及骨质疏松组与骨量正常组比较,CB2受体蛋白表达含量减少。3.RANKL诱导RAW264.7细胞5天后形成破骨细胞分化模型。RANKL诱导RAW264.7细胞5天后,RANKL组破骨细胞数目及TRAP活性较对照组明显增加（P＜0.05）。应用AM1241预处理后,AM1241+RANKL组较RANKL组及正常组破骨细胞数目增多,TRAP活性增强（P＜0.05）,应用AM630预处理后,AM630+RANKL组较正常组破骨细胞数目增多,TRAP活性增强（P＜0.05）,较RANKL组破骨细胞数目减少,TRAP活性减弱（P＜0.05）。WB实验发现AM1241+RANKL组及AM630+RANKL组Nrf2及HO-1表达含量均较RANKL组明显增加（P＜0.05）。构建si Nrf2-RNA质粒慢病毒干扰载体对上述过程加以干预,WB实验证实si Nrf2各组Nrf2及HO-1表达含量均较si RNA各组有所下降,其中AM1241及AM630干预下Nrf2及HO-1表达含量下降明显（P＜0.05）,siNrf2各组较si RNA各组破骨细胞数目增多,TRAP活性增强,其中si Nrf2+RANKL+AM630组较si RNA+RANKL+AM630组破骨细胞数目增多,TRAP活性增强（P＜0.05）,AM630抑制RANKL诱导RAW264.7细胞破骨细胞分化作用消失。结论:老年人群骨质异常与女性、BMI、前白蛋白、血尿酸、骨代谢标志物β-Crosslaps水平等因素密切相关,与CB2受体表达情况亦密切相关。干预CB2受体可影响RANKL介导的RAW264.7细胞的破骨细胞分化过程,CB2受体拮抗剂AM630可抑制RANKL介导的RAW264.7细胞的破骨细胞分化及活性,其机制可与Nrf2参与的氧化还原反应机制相关。CB2受体相关的骨代谢机制或可成为治疗老年人群骨质疏松的新的靶点。